表觀遺傳學在肺動脈高壓發病機制和治療中的研究進展

張春芳，徐雙蘭，趙方允，邢西遷，楊 姣

(昆明醫科大學附屬延安醫院 1. 呼吸內一科、2. 藥學部，云南 昆明 650051；3. 昆明醫科大學第一附屬醫院呼吸內一科，云南 昆明 650032)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension, PH)是指肺動脈壓力超過一定界值的一種血流動力學異常狀態，導致右心負荷增大和右心功能不全，從而引起一系列臨床表現。PH的病理生理特點為肺動脈壓力的升高及肺血管阻力的增加，通常導致右心衰竭和死亡。表觀遺傳學是研究在DNA序列沒有改變的情況下，基因功能可逆的、可遺傳改變的一門生物學學科[1]。大量研究表明，表觀遺傳學修飾異常在人類復雜性疾病如惡性腫瘤、神經精神疾病、心血管疾病等的發病機制中起重要的作用[2-4]。近年來，表觀遺傳學在PH方面的研究逐漸增多，其在該病發生、發展中的重要作用越來越被人們所認識。表觀遺傳學機制是基因和環境相互作用產生的，研究發現，超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)和顆粒容素基因位點的DNA甲基化狀態、組蛋白H1水平、組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)、microRNA的失調，這些因素相互作用形成表觀遺傳修飾調控網絡，共同參與PH的表觀遺傳學機制[5-6]。一些環境因素可能通過目前尚未發現的表觀遺傳學機制，導致PH的發生[1]。然而，有許多至今未闡明的PH的表觀遺傳成分。本文主要對DNA甲基化和組蛋白修飾在PH發生、發展中的作用，DNA甲基化轉移酶抑制劑、HDACs抑制劑及其他潛在治療靶點對PH的治療作用及機制進行綜述。

1 表觀遺傳學的基礎理論

DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNA是目前研究最廣泛和最深入的表觀遺傳分子機制。表觀遺傳在環境的影響下參與基因表達調控。

1.1DNA甲基化DNA甲基化是由DNA甲基轉移酶催化發生，并維持與調控。在哺乳動物細胞中，胞嘧啶特異性甲基轉移酶使CpG二核苷酸序列發生甲基化，從而調節基因表達和細胞分化[7]。DNA甲基轉移酶的作用主要是抑制DNA轉錄。CpG島發生甲基化會引起抑癌基因的沉默，原癌基因的低甲基化會引起該基因的過表達，這兩方面會導致腫瘤的形成[2]。總之，DNA甲基轉移酶對于DNA甲基化模式的調控至關重要，它們在機體發育以及疾病的發生、發展中都發揮重要作用。

1.2組蛋白修飾在常規的核小體中，共有4種組蛋白，H3、H4、H2A、H2B。每種組蛋白的2個拷貝結合在一起，形成了一個組蛋白八聚體；約146 bp的DNA片段按照左手螺旋的方式在這個八聚體外纏繞約1.8圈，就構成了1個核小體的核心顆粒。核小體通過控制DNA和組蛋白的結合性和轉錄活性，調節基因表達[7]。組蛋白的翻譯后修飾是表觀遺傳調控的核心手段。目前，已經發現了至少8種不同的修飾類型，其中最為常見的4種修飾，即乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，且都是可逆的[7]。乙酰化是最常見的表觀遺傳修飾。組蛋白乙酰化修飾發生在賴氨酸殘基，修飾的位點主要分布在H3和H4的N端尾部，組蛋白乙酰化水平升高與轉錄活性增加相關[1]。組蛋白乙酰化和去乙酰化是一個動態過程。翻譯后的廣泛組蛋白修飾的組合構成“組蛋白代碼”，是調控染色質結構和功能的重要手段[1]。

1.3非編碼RNA與基因表達調控非編碼RNA主要包括4類。第1類是管家基因的轉運RNA、核糖體RNA、核小RNA；第2類是小干擾RNA、與PIWI蛋白相互作用的RNA,它們是非編碼RNA中重要的一部分；第3類是microRNA,它起到一種微調的作用；第4類是長鏈非編碼RNA,它在基因調控中不僅能激活基因，還抑制基因。

2 表觀遺傳學成分在PH發生、發展中的機制

2.1DNA甲基化與PH

2.1.1SOD2 SOD2位于線粒體中，是內生的過氧化氫產生的主要來源。在生理層面上，過氧化氫是擴張血管、抗細胞增殖、氧化還原反應的信號分子[8]。SOD2是腫瘤抑制基因的候補者，在很多惡性腫瘤中是沉默狀態，如多發性骨髓瘤和胰腺癌中，SOD2基因啟動子區CpG島的甲基化導致該基因沉默[1]。腫瘤細胞中SOD2基因的去甲基化會恢復SOD2的活性，增加過氧化氫的生成，抑制腫瘤細胞的增殖，SOD2的甲基化也同樣出現在PH患者中[8]。

過量的活性氧和還原型輔酶Ⅱ氧化酶類的表達增加，在促成PH方面有重要作用，還原型輔酶Ⅱ氧化酶類是活性氧的主要來源[9]。正常情況下活性氧不斷地產生，同時也不斷地被SOD2等清除，保持一種平衡狀態。SOD2基因的甲基化，一方面降低了過氧化氫的產生，另一方面減少了對活性氧的清除。基因組測序表明，SOD2基因CpG島的甲基化選擇性地發生在肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)，而不在主動脈平滑肌細胞。據研究，在PH患者或動物模型的叢狀病變中分離出的PASMCs中，SOD2出現甲基化，使SOD2表達降低，減少過氧化氫的生成,激活低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α) 的活性，導致凋亡蛋白酶被抑制，增加細胞增殖/凋亡率，促成患有PH的患者和Fawn-hooled鼠的血管阻塞，肺動脈壓力升高[1, 8, 10]。

2.1.2顆粒溶素 最近從人類的外周血單核細胞和移植肺中提取的基因組DNA分析結果顯示，患有肺靜脈閉塞病的顆粒溶素基因的甲基化程度要比PH患者高，具體的分子機制還有待進一步研究。顆粒溶素基因可能為PH治療提供創新性的治療靶點[11-12]。

2.1.3胰島素樣生長因子-1 胰島素樣生長因子-1信號的表觀遺傳調控包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化修飾，在新生兒PH發病機制中起重要作用。胰島素樣生長因子-1信號分子的異常，導致肺動脈血管內皮細胞、平滑肌細胞功能紊亂，進而導致血栓形成、細胞異常增殖。進一步深入研究胰島素樣生長因子-1信號通路的表觀遺傳學改變，可能為新生兒PH的治療帶來新思路[13]。

2.1.4ATP結合盒轉運子A1 最近研究表明，PH患者的肺內皮細胞中，涉及脂質轉運途徑基因ATP結合盒轉運子A1的甲基化，使ATP結合盒轉運子A1的mRNA和蛋白表達下調，導致肺內皮細胞功能障礙，這可能與PH的病理生理有關[14]。

2.2組蛋白修飾與PH

2.2.1內皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 有研究表明，eNOS的超乙酰化與新生兒持續性PH的形成有關[15]。研究者通過給孕期大鼠吲哚美辛和宮內缺氧來誘導新生鼠持續性PH模型，發現在這種大鼠肺動脈內皮細胞中eNOS的表達量明顯增加，是eNOS的啟動子乙酰化所致。在此模型中，eNOS的表達上調與eNOS啟動子區域的H3和H4組蛋白乙酰化的升高有關，而且eNOS甲基化輕度降低[1]。導致eNOS超乙酰化的原因及在治療PH時怎樣去避免eNOS超乙酰化，有待進一步研究。

2.2.2肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2) MEF2是轉錄因子的一個家族，它在細胞分化與胚胎發育方面有重要作用。MEF2家族主要有4個成員：MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。其中，MEF2A和MEF2C在內皮細胞中高表達。內皮細胞特異性MEF2C缺乏小鼠視網膜血管的損傷減少，內皮細胞的凋亡降低，這表明MEF2在血管內是一個重要的內皮穩態轉錄因子[16]。最近研究表明，MEF2不僅在內皮中具有重要作用，而且在維持肺血管的動態平衡中也有效。MEF2的活性受損，導致肺動脈血管動態平衡的靶基因下調，包括miRNA-424和miRNA-503等， 進而導致PH的病理學變化[17]。

2.2.3內皮素-1 內皮素-1是一種強烈的血管收縮活性物質，可引起血管收縮和細胞增生。研究發現，新發生的低氧性PH的患者血清中內皮素-1、HIF-1α水平與肺動脈收縮壓呈正相關[18]。缺氧導致的胎兒宮內發育遲緩大鼠，在以后的生活中可引起不同程度的PH和肺血管重塑。研究證實，胎兒宮內發育遲緩很可能與組蛋白乙酰化水平和HIF-1α在內皮素-1基因核心的啟動子區域結合水平升高有關。這些表觀遺傳變化可能導致胎兒宮內發育遲緩大鼠在以后的生活中對缺氧高度敏感[19]。持續低氧導致肺動脈內皮細胞的損傷，內皮細胞所釋放的一氧化氮、內皮素、前列環素等活性物質發生異常，從而引起肺血管異常收縮，導致更嚴重的PH或肺血管重構[20]。結果表明，表觀遺傳學與繼胎兒宮內發育遲緩之后的缺氧性PH的發展有關，為進一步提高胎兒宮內發育遲緩相關的PH的預防和治療提供了一種新方向。

2.2.4線粒體去乙酰化酶3 最近發現，在特發性PH患者的PASMCs中，局限性的線粒體去乙酰化酶3的表達降低。敲除線粒體去乙酰化酶3的小鼠，線粒體去乙酰化酶3的表達量降低能夠抑制線粒體的功能，抑制細胞凋亡，激活數個與PH相關的轉錄因子，如HIF-1α、信號轉換器、活化T細胞的細胞核因子[11]。

2.2.5超氧化物歧化酶3(extracellular superoxide dismutase，EC-SOD或SOD3) SOD3是一種胞外的超氧化物歧化酶，能夠快速地把超氧化物分解成過氧化氫。SOD3是脈管系統中最豐富的一種超氧化物歧化酶，占所有SOD活性中的60%～70%。在PH或者其他心血管疾病的動物模型中，缺失SOD3會增加疾病的嚴重程度。研究表明，血管抗氧化酶SOD3，而不是SOD2的表達量在特發性PH中選擇性減少，其活性也降低。在眾多腫瘤的研究中，并沒有發現DNA的超甲基化可以降低SOD3的表達量。現已證實，Ⅰ類HDAC3可以降低SOD3的表達，增強特發性PH PASMCs的增殖。SOD3對不同類型的PH患者的細胞特異性調控機制，確定選擇性HDACs抑制劑是否可以提高SOD3的活性，還需進一步研究[21]。

3 表觀遺傳學與PH治療

3.1DNA甲基化轉移酶抑制劑用DNA甲基化轉移酶抑制劑5-氮-2′脫氧胞苷(5-aza-2′deoxycytidine，5-Aza-CdR)逆轉SOD2基因的甲基化狀態，不僅可以恢復SOD2的表達，提高細胞凋亡率，還可以降低患有PH的Fawn-hooled鼠PASMCs異常增殖；同樣，過表達PASMCs的SOD2基因或者通過提供SOD類似物(MnTBAP)可以逆轉PH Fawn-hooled大鼠PASMCs的過度增殖[10]。SOD2補充給藥和5-Aza-CdR在細胞實驗中都有效，表明這兩種方法在治療SOD2甲基化方面有較大作用，但是，目前SOD2表達量減少導致的PH發生、發展最主要的治療方法還是SOD2類似物MnTBAP。經證實，MnTBAP能夠逆轉活體PH的形成，并降低肺毛細血管前阻力血管的肌化[8,10]。

3.2HDACs抑制劑HDACs基因的表達通過乙酰化修飾控制PH，HDACs去除組蛋白上賴氨酸尾巴上的乙酰基團。通常去乙酰化會導致染色質濃縮，降低基因轉錄。HDACs抑制劑如丙戊酸，是HDAC I類抑制劑，用于治療癲癇和抗腫瘤；肟異羥肟酸是一個廣譜HDACs抑制劑，批準用于 T細胞淋巴瘤的治療。以上兩種藥物在治療PH模型方面有效[11]。I類HDACs抑制劑通過拮抗血小板源性生長因子對PASMCs的作用，抑制PASMCs的增殖和遷移，表明組蛋白去乙酰化酶與PASMCs的過度增生有關，抑制去乙酰化會產生細胞凋亡的效應[22]。HDACs抑制劑可以通過抗血管生成、促進細胞凋亡，實現逆轉右心室的功能，HDACs抑制劑也降低了心肌的纖維化[22-23]。還有研究表明，另一種HDACs抑制劑曲古抑菌素A通過增加特發性PH PASMCs中SOD3的表達，部分逆轉特發性PH[21]。然而，并不是所有的研究結果都得出HDACs抑制劑有利于右心室肥厚的逆轉。有研究報道，曲古抑菌素A處理的大鼠出現心輸出量減少和右心衰竭的跡象，這種結果和之前研究的HDACs對右心室肥厚和左心室肥厚有益相反。這表明可能有多種HDACs抑制劑，需要進一步研究一個特定的HDACs家族中是否有一特定的抑制劑亞型對右心室肥厚有益或有害[1, 23-24]。

4 結語

近年來，表觀遺傳學在PH方面研究發展迅猛，至今已發現很多可能與PH的發生、發展機制相關的表觀遺傳學成分，并對DNA甲基化和組蛋白乙酰化進行了藥物干預。文獻報道，DNA甲基轉移酶抑制劑和HDACs抑制劑在治療多種腫瘤方面可能有效[25]，但對于治療PH的動物實驗效果并不確切，有些還存在嚴重副作用。隨著分子生物學技術的突飛猛進，希望今后的研究中，對于已經確定的甲基化藥物干預和組蛋白去乙酰化藥物干預進行更精確的靶向治療；通過基因組學、蛋白質組學和代謝組學的高通量技術，進一步研究導致PH發生、發展的機制，發現新的表觀修飾作用的靶點，并對其進行靶向藥物或技術干預。雖然此過程可能不是一帆風順，但可以肯定的是，表觀遺傳修飾藥物或技術干預具有廣闊的應用前景。