感染加重慢性呼吸道疾病的小鼠模型研究進展

張國榮，劉 楠，徐 洋，劉 莉,3

(1. 中國醫藥工業研究總院藥理評價研究中心，上海 200040；2. 上海醫藥工業研究院創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437；3. 上海市生物物質成藥性評價專業技術服務平臺，上海 200437)

呼吸道病毒和細菌感染誘發的炎癥能夠使呼吸道疾病惡化，如哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、肺部囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)[1]，疾病惡化會導致死亡率升高。然而，目前缺乏有效的方法能阻止呼吸道疾病的發生和惡化。為了明確疾病的發病機制，發展并驗證新的治療方法，許多研究者致力于建立能夠準確模擬臨床人類呼吸道疾病特征的小鼠模型。通過對已發表的國內外文獻的調研，本文對感染加重以上3種常見呼吸道疾病的小鼠模型的研究現狀進行總結論述，以促進此類模型的正確運用以及治療藥物的研發。

1 感染加重哮喘的小鼠模型

呼吸道病毒和細菌感染與哮喘的發生及惡化息息相關[1]，迄今為止，已有大量關于小鼠呼吸道感染加重哮喘的研究。本部分內容根據小鼠感染年齡的不同，將此類研究分為兩種，分別是生命早期感染和成年期感染。

1.1生命早期感染加重小鼠的哮喘模型早期的研究表明，新生兒和初生小鼠的Ⅱ型T輔助細胞(T helper cell 2，Th2)的免疫調節活性遠低于成年期，所以許多研究者開始應用初生的小鼠模型研究感染加重哮喘的機制[2]。

已知呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染能夠誘導兒童支氣管哮喘的發生和發展[3]。Siegle等[4]在小鼠初生即感染鼠肺炎病毒(與RSV同種屬)，感染恢復后，滴鼻給予卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏，再使其長期吸入霧化OVA，發現小鼠成功發展為慢性哮喘，并導致Th2相關的細胞因子包括白介素4(interleukin 4，IL-4)、IL-5、IL-13表達增多。

鼻病毒(rhinovirus，RV)感染是嬰幼兒哮喘發病的高危因素。Han等[5]發現，RV感染能夠誘導小鼠的肺部黏液化生和氣道高敏(airway hyperreactivity，AHR)，2型先天性淋巴細胞(type 2 innate lymphoid cells，ILC2s)的數目以及IL-13、IL-25的表達增加，并且缺乏正常的γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)反應[6]。進一步的研究發現，通過恢復小鼠的IFN-γ反應，能抑制表達IL-13的ILC2s的擴增，從而抑制哮喘的發展，說明IFN-γ可能是治療哮喘的靶標[6]。Han等[5]應用Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)基因敲除小鼠發現，TLR2+巨噬細胞是RV誘導感染的必要因素。

此外，研究者發現，生命早期的肺炎衣原體感染能夠誘導Th2免疫反應，以及肺部結構和功能的永久性改變[2]。Starkey等[7]使腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)基因敲除的小鼠感染肺炎衣原體，發現TRAIL與生命早期衣原體感染的嚴重程度相關。此外，Starkey等[8]發現，在敲除IL-13基因的小鼠體內，感染誘導的持續AHR消失，應用抗IL-13的單克隆抗體可以防止嚴重過敏性氣道病的發生。由此推斷，通過靶向TRAIL和IL-13，可能對生命早期衣原體感染誘導的嚴重哮喘有治療作用。

總之，以上研究表明，生命早期的呼吸道感染可能對肺部結構和免疫反應產生永久性的改變作用。

1.2成年期感染加重小鼠的哮喘模型感染使哮喘惡化的成年病人也會表現出AHR和Th2細胞反應增強等病理特征。然而，成人的呼吸道感染更多會誘導抵抗類固醇治療的中性粒細胞炎癥[1]。目前，研究者也建立了此類哮喘小鼠模型來進一步探究感染與哮喘的關系。

大量的臨床數據表明，呼吸道衣原體感染與嚴重的抵抗類固醇治療的哮喘相關[9]。 Horvat等[10]使小鼠在經OVA敏化和激發前7 d感染衣原體，發現衣原體感染能使OVA誘導的Th2反應和嗜酸性粒細胞炎癥減輕，但會使Th1和Th17反應以及中性粒細胞炎癥增加。Kim等[9]發現，中性粒細胞的數量與炎癥小體3(inflammasome 3，NLRP3)和IL-1β mRNA的表達呈正比。通過給予模型小鼠IL-1β的中和抗體能夠使IL-1β的表達水平降低，氣道炎癥和AHR減輕，說明靶向肺部增高的IL-1β可能是難治性哮喘的有效治療靶標[9]。Essilfie等[11]應用流感嗜血桿菌，也得出Horvat等類似的結果，此外還發現中性粒細胞的炎癥增加與IL-17的表達增加相關，通過應用抗IL-17的單克隆抗體能消除感染誘導的中性粒細胞炎癥。

Chen等[12]應用RSV感染加重哮喘的小鼠模型證實，溴結構域(bromodomain and extra-terminal, BET)蛋白抑制劑能明顯抑制AHR，減少巨噬細胞和中性粒細胞的數量以及細胞因子的表達水平，說明BET蛋白可以作為治療抵抗類固醇的炎癥性哮喘的潛在靶標。

總之，細菌或病毒進入體內后會首先利用Th2細胞免疫應答的不足來加重哮喘癥狀，然后通過誘導Th1和(或)Th17免疫反應，造成抵抗類固醇治療的嚴重哮喘[1]。

2 感染加重COPD的小鼠模型

COPD是一種由有害氣體或顆粒引起的，以慢性阻塞性細支氣管炎、肺氣腫和黏液堵塞為病理特點的，慢性進行加重的呼吸系統疾病。COPD病人病情的惡化通常是由并發癥的發展或呼吸道細菌或病毒感染所致[16]。本部分內容根據COPD模型小鼠建立的不同，將研究者對于感染加重COPD小鼠模型的研究分為兩類。

2.1感染加重吸煙誘導的COPD小鼠模型由于吸煙是人類COPD的主要誘因，所以吸煙誘導COPD的小鼠模型能夠準確模擬人類COPD的發生[13]。流行病學研究顯示，大約一半的COPD病人的病情惡化是由病毒感染引起的，常見的有流感病毒、RSV、RV[14]。研究者使BALB/c小鼠暴露于煙霧4 d(短期)后感染流感病毒，發現與單純吸煙或病毒感染的小鼠相比，經雙重刺激小鼠的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的巨噬細胞、中性粒細胞、病毒特異性CD8+T淋巴細胞數目增多[13]。研究者使C57BL/6小鼠吸煙3～5個月(長期)后也發現，流感病毒感染能夠加重炎癥反應，具體表現出氣道中TNF-α、IL-6、IFN表達的增加，以及死亡率的升高[14]。

由于應用活性病毒的實驗需要采取防護措施，且實際操作困難，研究者應用聚肌胞苷酸[poly(I:C)]模擬病毒感染，成功建立了COPD惡化的小鼠模型，并發現香煙暴露與poly(I:C)共刺激能夠加速肺氣腫和氣道纖維化的進程，增加中性粒細胞的數量，增強AHR[13]。

呼吸道細菌感染也是COPD惡化的誘因，Richmond等[15]使能自發發展為COPD表型的多聚免疫球蛋白基因敲除的小鼠吸煙6周后，感染流感嗜血桿菌，發現小鼠的小氣道壁重塑程度和肺氣腫癥狀加重，巨噬細胞和中性粒細胞數目增多。Pichavant等[16]使小鼠吸煙12周后感染肺炎鏈球菌，發現小鼠體內的IL-17和IL-22的表達增加。以上研究表明，細菌感染和香煙暴露對COPD惡化有協同促進作用。

結合臨床研究的結果分析，以上小鼠模型能夠模擬感染使COPD惡化的病理特征，可以被用于進一步探索疾病機制和開發新的治療方法。

2.2感染加重彈性蛋白酶誘導的COPD小鼠模型雖然吸煙誘導的COPD小鼠模型能夠模擬人類COPD的發病特征，但即使長期煙霧暴露也很難造成嚴重的COPD。考慮到人體內彈性蛋白酶的失調能夠誘導COPD，研究者開始應用其作為COPD模型小鼠的誘因[17]。Ganesan等[18]給小鼠灌注4周彈性蛋白酶和LPS，誘導COPD樣肺部炎癥和肺氣腫，然后使小鼠感染流感嗜血桿菌，發現小鼠體內的細菌清除能力下降，中性粒細胞炎癥增加，黏液分泌時間延長，與巨噬細胞吞噬作用相關的清道夫受體A表達減少[18]。研究顯示，清道夫受體A在小鼠體內的細菌清除能力中發揮重要作用，其基因突變也會增加人類COPD的發病風險。然而，Singanayagam等[17]表示，多次接觸彈性蛋白酶和LPS后感染RV的模型小鼠，不能模擬臨床RV感染加重COPD的病征。相反，通過單次給予彈性蛋白酶后滴鼻感染RV的方式，可以使氣道中的中性粒細胞炎癥升高，包括TNF-α、CXCL10、CCL5、CXCL2表達增加，黏液分泌增加和AHR。此外，研究者分析了可能造成第1種造模方式失敗的原因，一是長期LPS暴露會減少中性粒細胞數量，以及RV誘導的中性粒細胞趨化因子的表達；二是大量的彈性蛋白酶會導致嚴重的肺損傷，從而會阻礙之后的炎癥反應[17]。

總之，以上研究表明，感染加重彈性蛋白酶誘導的COPD小鼠模型，可以模擬臨床COPD惡化的病理特征。然而，關于彈性蛋白酶的應用方法還存在爭議，今后需要進一步研究驗證，從而促進這種建模方式的應用。

3 感染加重肺部CF的小鼠模型

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)感染在肺部CF病人中最為常見，長期的呼吸道PA感染也是肺部CF病變最嚴重的風險因素[19]。所以，本部分內容主要總結目前關于PA感染使兩種小鼠模型(野生型和基因改造型)肺部CF惡化的研究進展。

3.1PA感染加重基因改造小鼠的肺部CFCF是一種因囊性纖維化跨膜受體(CF transmembrane regulator，CFTR)失調而誘發的復雜的多器官疾病，其中肺部CF是CF研究的熱點[20]。早在1992年，先天患有CF的CFTR基因敲除(Cftr-/-)小鼠建立,并被廣泛應用于疾病機制的探索[20]。Wu等[20]給Cftr-/-小鼠鼻內滴注PA的LPS，發現小鼠的氣道狹窄加劇，BALF中的花生四烯酸和前列腺素增多，隨之證實，能促進花生四烯酸產生的胞質型磷脂酶A2α(cytosolic phospholipase A2α，cPLA2α) 在氣道狹窄的誘導中發揮重要作用，可以被用作肺部CF的治療靶標。Paroni等[21]也發現，耐藥性PA菌株感染使Cftrtm1UNC小鼠的白細胞數量增多，細胞因子和趨化因子的表達水平增加，此外還發現，穿透素3能夠使CF小鼠肺部的IL-17和CCL2/MCP-1表達水平明顯降低，顯示出良好的治療效果。

除了關注CFTR，Antje等[22]也探究了小鼠基因型對CF的影響，發現Cftrtm1Unc-Tg(FABPCFTR)1Jaw/J小鼠與其同源野生型小鼠被PA感染的影響程度較低，然而CftrTgH(neoim)Hgu小鼠與其同源野生型小鼠表現出嚴重的感染癥狀，說明在PA感染誘導CF的發展中，基因背景可能比CFTR失調更為重要。 然而，Emanuela等[23]的研究指出，雖然野生型小鼠和Cftr-/-小鼠在長期接觸PA的LPS后，都表現出肺部損傷，但野生型小鼠很快恢復正常，Cftr-/-小鼠卻轉變為長期慢性炎癥,說明Cftr-/-小鼠在此類模型的應用中顯現出明顯優勢。

3.2PA感染誘導野生型小鼠產生嚴重肺部CF在應用野生型小鼠時，研究者關注的是，通過PA菌株和小鼠基因型的選擇以及造模方式的改進，使PA在小鼠肺部定植時間延長，建立慢性嚴重性肺部CF小鼠模型。在PA的應用中比較明確的是，給小鼠氣管或鼻內移植固定介質(如瓊脂、瓊脂糖、海藻藻酸鹽等)包裹的PA菌株能延長細菌在小鼠體內的定植時間[19]。黏液型PA比同源非黏液型菌株在小鼠肺中的存活率更高。此外，接種菌株的數目也會影響造模效果[19]。

不同的小鼠品系具有不同的疾病易感性，如C57BL/6NCrlBR小鼠易感急性中性粒細胞炎癥為主的廣泛組織損傷。然而，組織損傷較輕或無的慢性肉芽腫樣炎癥在BALB/c中更為常見。此外，小鼠品系之間微小的基因型差異也會影響慢性PA的易感性[19]。

Facchini等[24]成功地使PA的臨床株RP73在C57Bl/6NCr小鼠的氣管內存在了3個月以上，而且小鼠的肺部病變與晚期肺部CF患者相似。Bayes等[25]給C57BL/6小鼠氣管內接種PA的臨床黏液株NH57388A，小鼠表現出急性死亡率降低、體質量降低、中性粒細胞增多、抗生素治療無效等人類CF特征。兩個研究都指出，發展為慢性PA感染的小鼠是支氣管或部分肺葉的感染，而不是整個肺實質的感染，說明部分肺部感染可能是實現慢性感染的關鍵[24-25]。

4 結語

小鼠模型是幫助研究氣道炎癥誘發疾病和疾病惡化進程的有效工具，通過控制感染的時間和水平以及其他條件，模型小鼠能夠比較準確地反映感染對慢性呼吸道疾病的影響，幫助闡明疾病的機制，識別疾病治療的新靶點，此外，還可用于新方法療效的驗證[1]。

通過小鼠模型的應用，研究者已經發現，生命早期的病毒和細菌感染會改變肺部結構和免疫應答，加重哮喘[5]。在接下來的生命進程中，免疫表型會被進一步改變，發展為抵抗類固醇治療的嚴重疾病癥狀[11]。吸煙或彈性蛋白酶誘發COPD小鼠的呼吸道感染會使氣道和肺泡的炎癥和重塑水平進一步增加[13,17]。PA感染能夠加重肺部CF小鼠的疾病癥狀，同時CF小鼠更易遭受PA感染。然而，還有很多機制未明的臨床案例有待建立相應的小鼠模型，例如生命早期感染結合成年期吸煙加重哮喘，以及生命早期病毒和細菌共感染誘發哮喘。目前，有研究建立了病毒誘導二次感染細菌的COPD小鼠模型，應用不同的病原感染時間和細菌病毒組合建立的模型，表現出相似的病毒細菌共感染的機制，例如病毒感染恢復期間產生的干擾素會損害機體的細菌防御屏障等[14]，但是這種小鼠模型還有待完善。

值得注意的是，考慮到實驗操作中存在的安全風險因素，通過動物模型得到的實驗結果是不可能在臨床人體上驗證的，所以，在解釋小鼠模型表現出的結果以及將結果轉換到人類研究時，必須注意確保疾病特征的一致性[14]。由于人類和小鼠之間存在種屬差異，而且幾乎不可能在生命周期過短的小鼠身上復制人類經過多年的多重感染才引發的疾病的特征，所以動物模型幾乎不可能精確模擬人類疾病[23]。但是，在充分了解疾病基礎上發展臨床前動物模型，將會對人類疾病的研究提供極大幫助。