小鼠腸道菌群對外周免疫器官影響的研究進展①

薛淮娟 馬 龍 秦 歡 姚新生

(遵義醫學院免疫教研室，遵義 563000)

1 腸道菌群的存在方式及作用

腸道菌群作為目前熱門的研究領域之一，在腫瘤的防治與研究、免疫系統相關疾病的發生與治療、生活規律的形成影響及抑郁癥的發生發展中，均被證實具有重要的誘導甚至參與主要的調控作用[1,2]。根據菌群對宿主的影響可大致分為：共生型、致病型、共生致病型。而體內如此多樣功能各異的腸道菌群主要是由它們自身產生的蛋白質和代謝產物，通過直接或間接的方式相互協調相互作用，從而增強對宿主的防御以及提高營養的獲得和保持在炎癥環境下的持續存在[3]。但這些微生物很少作為單一的個體存在于體內例如浮游生物的形式，相反它們存在于被統稱為生物膜的區域內，通過自己產生的聚合物基質從而避免遭受機體的免疫攻擊。而每一個生物膜區內均含有數百個不同的微生物，其中具有毒性的細菌可以保護生物膜免受外界侵擾，而其他物種則主要為生物膜區獲取相應的營養。隨著生物膜區的形成和不斷發展，會導致其內微生物的集體基因表達發生顯著變化[4]。其中腸道病毒作為機體常見的感染源即可通過“跨界相互作用”與腸道微生物相互調控，并且越來越多的研究認為這一調控方式是導致疾病具有傳染性、誘導性和調控性的關鍵點之一,例如小鼠乳腺腫瘤病毒可與革蘭氏陰性菌表面的脂多糖結合，從而激活了宿主的先天免疫反應，導致機體對小鼠乳腺腫瘤病毒的復制和傳播均表現為高度的耐受性[5]。而作為共生致病型微生物代表的大腸桿菌其可通過獲取新基因，或通過丟失基因的方式改變目前的基因組從而改變自身功能機制并產生致病性的演變，從而以共生型和治病型兩種不同形式存在于體內[4]。而腸道中具有重要調節作用的共生菌，其與機體相互依賴協調發展的基礎，主要來源于宿主細胞和組織對共生菌所產生的免疫刺激途徑的耐受能力，例如共生菌所攜帶的LPS可通過激活Toll樣受體4途徑，而Hennezel團隊[6]發現機體腸道免疫系統對LPS所介導的TLR4信號保持沉默，主要存在于全部的擬桿菌及共生菌的部分非免疫結構特征中,并且證實LPS介導的免疫耐受是體內共有微生物的固有特征。

2 小鼠腸道菌群對腸道免疫系統的影響

機體黏膜表面是非自身抗原與機體相接觸的第一道關卡，其中腸道已經發展成為獨特的淋巴器官，并且腸道免疫系統已被公認為機體最大免疫器官，不僅需要肩負管理食物代謝、營養吸收和防御病原體的使命，還需要維持機體免疫平衡、協調機體免疫耐受，是機體行使免疫監視的第一道防線。小鼠機體內不同作用的腸道微生物群所啟動的免疫調節機制是大相徑庭的，雖然微生物調節腸道免疫系統的機制正在深入研究之中，但目前認為主要有兩種方式：①與宿主細胞的直接相互作用；②通過與膳食代謝物相作用或者自己產生的免疫調節分子來調節腸道免疫系統，其可為腸黏膜細胞提供某些維持功能的必需成分，與機體形成互惠互利的特殊共存關系[7]。

2.1腸道菌群間接影響腸道免疫功能的調節 來自于消化道中的食物殘渣經厭氧菌發酵后會產生多種代謝產物，包括蛋白質、多糖和激活模式識別受體的分子，如Toll樣受體和NOD樣受體均可刺激黏膜免疫系統[8]，并且其產生的化學信號對于腸道免疫反應的重要性已被證實。而結腸中食物經細菌發酵后所產生的主要產物是短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids，SCFAs)包括乙酸、丁鹽酸和丙酸，其可通過腸上皮細胞進入并與宿主細胞相互作用，吸收后在血清中循環并影響宿主的免疫反應和發生疾病的風險，并可抑制具有促進維持免疫穩態的抗炎型細胞作用的組蛋白脫乙酰酶[1]。其中丁鹽酸作為細菌菌株特異性分子的代表，是組蛋白去乙酰化酶的抑制劑及G蛋白偶聯受體的配體，被認為是影響宿主免疫反應的關鍵信號分子[9]。而據最近的報道又發現丁鹽酸對于腸道巨噬細胞具有免疫調節作用，故對結腸中的共生菌呈現低反應性[10]。在與普通環境下的小鼠相比無菌小鼠其結腸中具有較高水平的可發酵底物及低水平的SCFAs，由此可見SCFAs主要由微生物在腸內產生[11]。

2.2腸道菌群參與T細胞免疫功能的調節 正常穩態下腸腔內富含大量的T細胞，并對腸道內不同的抗原進行識別、清除及形成相應的耐受，一旦小鼠腸道菌群失調后不僅多數細胞因子例如IL-7、IL-10、IL-22及IFN-g會發生變化[12]，同時T細胞中的Th1、Th17、Treg也會出現明顯減少[13]。但當無菌小鼠腸道內給予部分定植細菌后，細胞因子的產生又恢復到正常水平，并且Th1和Th17細胞數目也明顯增加，由此可知腸道中T細胞正常功能的維持依賴于共生菌群的存在[14]。同時Ivanov團隊[12]發現小腸固有層中Th17細胞分化需要特定的共生微生物群。其中與腸道中的黃桿菌、擬桿菌存在密切的相關，雖然獨立于TLR、IL-21或IL-23的信號轉導，但卻需要適當的TGF-β活化。同時他們發現腸道菌群可調節小腸固有層中Foxp3+Treg細胞與Th17細胞的平衡，腸道微生物群的組成便成了此協調作用的關鍵點[7]。并且通過對無菌小鼠的研究后發現其體內CD4+CD25+T細胞的數量也明顯減少[15]。故腸道菌群的減少甚至是消失對于腸道中主要調控免疫耐受功能的Treg細胞存在重要影響。但Cording團隊[16]通過長期使用抗生素消耗掉腸道中菌群后發現，小鼠機體中CD4+T細胞的增殖呈全身性減少，但Foxp3+Treg的增殖僅在腸道中的MLN和PPs中受損。

進一步的研究發現腸道菌群對于小鼠T細胞的免疫功能還具有免疫佐劑功能。腸道中的共生菌有富含非甲基化核苷酸受體序列的寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)，而CpG-ODN已具有與CD28相似的共同刺激T細胞活化的功能。并且CpGA類還具有誘導PDC產生INF-α，誘導NK細胞產生INF-γ，誘導單核細胞轉變為成熟的樹突狀細胞的作用，同時CpG-ODN對T細胞的固有特性可能有助于微生物DNA和CpG-ODN對T細胞介導的免疫反應的佐劑效力[17]。同時作為腸道菌群與食物殘渣相互作用后所產生的丁鹽酸也可參與Treg細胞的調控能力，實驗發現在丁鹽酸參與的初始CD4+T分化為Treg中，作為Foxp3啟動子的組蛋白3賴氨酸27乙酰化水平可增高，同時非編碼保守序列1、非編碼保守序列2的增強子水平也可提高，從而發現Foxp3的誘導能力和Treg的調節能力均明顯提升[18]。可見無論是腸道菌群的直接作用或是間接作用，它們的存在對于小鼠腸道中及體內T細胞功能的調控都起了關鍵性的作用。

2.3腸道菌群參與B細胞免疫功能的調節 在腸道PPs中含有大量B細胞的生發中心，作為腸道免疫系統中的效應細胞，腸道菌群的改變對PPs的免疫功能也產生了一定的影響。研究發現在無菌小鼠體內腸黏膜免疫力不足，動物呈現較小的腸系膜淋巴結，PPs的發育不良，并且具有分泌IgA功能的漿細胞數量也明顯減少，對抗病原菌的能力也明顯減弱[19]，但將普通小鼠的腸道菌群移植給無菌小鼠后，此種狀態即被逆轉[20]。腸道菌群原核DNA的非甲基化核苷酸受體B類(CpG-B)可誘導體內共刺激分子和TNF-α產生并表達PDC，并且可上調B細胞的活化標志物和IL-6的表達量[21]。并且凋亡碎片所產生的非甲基化核苷酸受體還可以激活TLR9，特別是在它們被轉化為自身抗體的免疫復合物的情況下，然后通過TLR9和B細胞受體進一步刺激B細胞，從而引起自身免疫性疾病的發生[22]。同時腸道菌群還可誘導腸道PPs中B細胞生發中心的短暫擴張，促進PPs中的B細胞發育，由于B細胞是分泌型IgA(SIgA)及部分免疫球蛋白E(IgE)的前體細胞，故B細胞的增多可進一步促進相關Ig的生成。正常小鼠出生后即具備形成SIgA 應答能力，6周時IgA分泌細胞數量才能達到成年小鼠水平，而IgA分泌延遲的關鍵源于小鼠從出生至斷乳期，不同喂養順序所建立的腸道菌群經刺激過程。并且Myunghoo團隊[23]最近證實腸道菌群參與產生的SCFAs，不僅具有刺激宿主抗體反應性的作用，還具有加快細胞代謝，調節基因表達，促進B細胞向抗體生成細胞分化的能力，結果進一步揭示了微生物代謝物在調節宿主抗體反應中的重要性。

2.4腸道菌群參與口服耐受的調節 早在20年前口服耐受就開始受到人類的關注，而最近一些觀點也反復支持即環境因素(例如抗生素，飲食，接種疫苗)改變在過敏性致敏的調節中起重要作用[24]。Andrew[25]團隊發現無菌小鼠及抗生素處理過的小鼠對食物過敏原的致敏力增強，無法形成有效的口服耐受，之后通過對無菌小鼠進行菌群移植，并運用基因分析技術對無菌小鼠腸上皮進行檢測分析，他們發現了梭狀芽胞桿菌調節先天性淋巴細胞功能和腸上皮通透性從而保護腸道過敏源致敏的新機制，從而論證含有梭菌的微生物群在保護腸道對食物產生過敏的免疫反應中起重要作用。在口服耐受中具有重要調節作用的Treg細胞，特別是經由食物抗原產生的Treg，不僅在腸道形成并定植并且在全身循環中也被發現，其在維持系統性免疫耐受中也起重要作用[26]。Kim團隊[27]發現將流質飲食喂養給無菌小鼠后，其小腸中由食物抗原誘發的Treg細胞在黏膜固有層增殖和增多，而微生物群則在結腸中誘發由外周誘導而產生的Treg(pTreg)細胞，實驗發現在結腸中經微生物誘導產生的表型為RORγt 1的pTreg細胞，與經食物抗原誘導產生的pTreg細胞在表型和功能上出現了明顯的差異，并且表型為RORγt 1的pTreg細胞其壽命不僅明顯大于pTreg細胞，其在協調機體免疫耐受中也起重要作用。同時Rask團隊[28]的研究發現，給予單一定植菌的悉生(gnotobiotic)小鼠或無菌小鼠與普通小鼠比較，后者能通過上調小腸黏膜上皮主要組織相容性復合體Ⅱ(MHCⅡ)的表達，誘導OVA的口服耐受；而單一定植菌的悉生小鼠或無菌小鼠則不能，由此可知口服耐受的誘導和形成不僅需要腸道菌群的配合，還需要多種腸道菌群的協同作用才可完成。并且盡早建立腸道共生菌群，及保持腸道菌群的長期穩態平衡，才能促使小鼠腸道的口服耐受更加完善。

3 小鼠腸道菌群對脾臟的影響

早期的研究就發現居住環境的影響導致腸道殖民菌群的不同，最終對小鼠脾臟的結構和功能產生了影響，例如與生長在正常環境中的小鼠相比，無菌小鼠血清中IgG的分泌量明顯下降，同時脾臟和淋巴結中B細胞區域和T細胞區域的結構是混亂的[29]，其中脾臟中B細胞的生發中心不僅少而且小，進而影響B細胞的分化和成熟[30]。Arya團隊[31]通過實驗發現無菌小鼠脾臟中巨噬細胞的標志物F4/80hi和巨噬細胞，單核細胞和嗜中性粒細胞組成的多樣性群體標志物F4/80lo細胞的比例和總數均減少，他們發現無菌小鼠脾臟中的多樣性群體均減少，而用抗生素治療SPF小鼠后也會導致脾臟中的骨髓細胞群減少，由此可推論腸道菌群可動態地影響外周免疫器官的先天免疫細胞比例，故可進一步認為腸道菌群在機體免疫細胞的初級發育階段中占有重要的位置。并且腸道菌群不僅具有調節免疫系統的功能性，在維持外周循環中的中性粒細胞數量和脾臟中的CD4+T細胞功能上均起了重要的作用[32]。由此可見腸道菌群的存在不僅只對胃腸道的免疫細胞產生影響，對于機體遠處免疫器官的發育、發展也有明顯影響。

目前科學家外對腸道菌群與腸黏膜免疫相互作用的調控機制研究已逐步深入，通過對各個靶點及關鍵調控點的研究，研究人員已發現許多因腸道菌群穩態改變而引起的免疫性疾病及腫瘤發生的原因。相信隨著對腸道菌群與機體之間協同作用的進一步探究，將幫助人類發現更多疾病的發病機制，并對相關疾病的治療提供新證據及思路。

參考文獻：

[1] Rooks MG,Garrett WS.Gut microbiota,metabolites and host immunity[J].Nat Rev Immunol,2016,16(6):341-352.

[2] Sommer F,B?ckhed F.The gut microbiota--masters of host development and physiology[J].Nat Rev Microbiol,2013,11(4):227-238.

[3] Hajishengallis G.The inflammophilic character of the periodontitis-associated microbiota[J]. Mol Oral Microbiol,2014,29(6):248-257.

[4] Proal AD,Lindseth IA,Marshall TG.Microbe-microbe and host-microbe interactions drive microbiome dysbiosis and inflammatory processes[J].Discov Med,2017,23(124):51-60.

[5] Pfeiffer JK,Virgin HW.Viral immunity.Transkingdom control of viral infection and immunity in the mammalian intestine[J].Science,2016,351(6270).pii：aad5872.

[6] d′Hennezel E,Abubucker S,Murphy LO,etal.Total lipopolysaccharide from the human gut microbiome silences Toll-like receptor signaling[J].mSystems,2017,2(6).pii:e00046-17.

[7] Agace WW,McCoy KD.Regionalized development and maintenance of the intestinal adaptive immune landscape[J].Immunity,2017,46(4):532-548.

[8] Abreu MT.Toll-like receptor signalling in the intestinal epithelium:how bacterial recognition shapes intestinal function[J].Nat Rev Immunol,2010,10(2):131-144.

[9] Koh A,De Vadder F,Kovatcheva-Datchary P,etal.From dietary fiber to host physiology:short-chain fatty acids as key bacterial metabolites[J].Cell,2016,165(6):1332-1345.

[10] Chang PV,Hao L,Offermanns S,etal.The microbial metabolite butyrate regulates intestinal macrophage function via histone deacetylase inhibition[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(6):2247-2252.

[11] Cait A,Hughes MR,Antignano F,etal.Microbiome-driven allergic lung inflammation is ameliorated by short-chain fatty acids[J].Mucosal Immunol,2017,25:1-11.

[12] Ivanov II,Frutos Rde L,Manel N,etal.Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine[J].Cell Host Microbe，2008,4(4):337-349.

[13] Takiishi T,Fenero CIM,Cmara NOS.Intestinal barrier and gut microbiota:Shaping our immune responses throughout life[J].Tissue Barriers,2017,6:e1373208.

[14] Macpherson AJ,Harris NL.Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system[J].Nat Rev Immunol,2004,4:478-485.

[15] Hara N,Alkanani AK,Ir D,etal.The role of the intestinal microbiota in type 1 diabetes[J].Clin Immunol,2013,146(2):112-119.

[16] Cording S,Fleissner D,Heimesaat MM,etal.Commensal microbiota drive proliferation of conventional and Foxp3(+)regulatory CD4(+)T cells in mesenteric lymph nodes and Peyer′s patches[J].Eur J Microbiol Immunol(Bp),2013,3(1):1-10.

[17] Landrigan A,Wong MT,Utz PJ.CpG and non-CpG oligodeoxynucleotides directly costimulate mouse and human CD4+T cells through a TLR9-and MyD88-independent mechanism[J].J Immunol,2011,187(6):3033-3043.

[18] Arpaia N,Campbell C,Fan X,etal.Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation[J].Nature,2013,504(7480):451-455.

[19] Sommer F,Backhed F.The gut microbiota-masters of host development and physiology[J].Nat Rev Microbiol,2013,11(4):227-238.

[20] Lin L,Zhang JQ.Role of intestinal microbiota and metabolites on gut homeostasis and human diseases[J].BMC Immunol,2017,18(1):2.

[21] Avalos AM,Latz E,Mousseau B,etal.Differential cytokine production and bystander activation of autoreactive B cells in response to CpG-A and CpG-B ODNs1[J].J Immunol,2009,183(10):6262-6268.

[22] Viglianti GA,Lau CM,Hanley TM,etal.Activation of autoreactive B cells by CpG dsDNA[J].Immunity,2003,19(6):837-847.

[23] Myunghoo Kim,Yaqing Qie,Jeongho Park,etal.Gut microbial metabolites fuel host antibody responses[J].Cell Host Microbe,2016,20(2):202-214.

[24] Cho I,Blaser MJ.The human microbiome:at the interface of health and disease[J].Nat Rev Genet,2012,13(4):260-270.

[25] Stefka AT,Feehley T,Tripathi P,etal.Commensal bacteria protect against food allergen sensitization[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(36):13145-13150.

[26] Scurlock AM,Vickery BPHourihane JO,etal.Pediatric food allergy and mucosal tolerance[J].Mucosal Immunol,2010,3:345-354.

[27] Kim KS,Hong SW,Han D,etal.Dietary antigens limit mucosal immunity by inducing regulatory T cells in the small intestine[J].Science,2016,351:858-863.

[28] Rask C，Evertsson S，Telemo E，etal.A full flora，but not monocolonization by Escherichia coli or lactobacilli，supports tolerogenic processing of a fed antigen[J].Scand J Immunol，2005，61(6)：529-535.

[29] Benveniste J,Lespinats G,Adam C,etal.Immunoglobulins in intact,immunized,and conta minated axenic mice:study of serum IgA[J].J Immunol,1971,107(6):1647-1655.

[30] Crabbé PA,Bazin H,Eyssen H,etal.The normal microbial flora as a major stimulus for proliferation of plasma cells synthesizing IgA in the gut.The germ-free intestinal tract[J].Int Arch Allergy Appl Immunol,1968,34(4):362-375.

[31] Arya Khosravi,Alberto Yáez,Jeremy G.Price,etal.Gut microbiota promotes hematopoiesis to control bacterial infection[J].Cell Host Microbe,2014,15(3):374-381.

[32] Bugl S,Wirths S,Radsak MP,etal.Steady-state neutrophil homeostasis is dependent on TLR4/TRIF signaling[J].Blood,2013,121(5):723-733.