幽門螺旋桿菌候選疫苗抗原的研究進展①

趙 翠 趙福廣 黃利亞

(吉林農業大學生命科學學院，長春 130118)

1 前言

HP是一種螺旋形，寄居于人胃黏膜上的一種革蘭氏陰性微需氧菌，對生長條件要求十分苛刻。HP不依賴組織入侵的方式定植于胃上皮黏膜，這在很大程度上有利于逃避宿主免疫機制，同時，HP有整合環境DNA的能力，這種能力增加了HP在變化的環境中得以生存的機會[1]。HP感染后的臨床表現多樣性提示了HP致病機制的復雜性。在與疾病的相關性方面，HP是慢性胃炎、十二指腸潰瘍等的主要致病菌，且與胃癌、胃黏膜相關淋巴組織(Mucosa associated lymphoid tissue,MATL)惡性淋巴瘤的發生有密切聯系。最近的研究表明[2]，HP與神經退行性疾病的關聯性呈上升趨勢，此外在多發性硬化患者中HP檢出率極低，推測HP可能是發展多發性硬化的保護因子[3]。在對HP疫苗的探究過程中，圍繞全菌體抗原進行的攻毒試驗獲得了較為理想的免疫保護率，但因其成分復雜，安全性差等缺點，將其作為疫苗應用于人體，還需進一步研究。因此，研制一種經濟、高效、安全的治療性疫苗是防治HP感染的有效途徑，而篩選高效抗原又是疫苗研制工作的重中之重，本文就HP疫苗的候選抗原的研究近況及發展前景作一綜述。

2 抗原研究進展

2.1尿素酶 尿素酶(Urase)位于細菌表面，包括UreA和UreB兩個結構基因，其豐富的蛋白含量約占全菌蛋白的5%～10%。在HP的致病機制方面，尿素酶主要通過水解尿素產生氨和二氧化碳，調節細菌細胞周圍的pH值，是HP在高強度胃酸中得以生存和定植的關鍵[4]，同時尿素酶是HP重要的定植因子和毒力因子，因此，“無酸無潰瘍”的傳統觀點已經被打破。

目前，對尿素酶的研究比較廣泛，秦玉紅等[5]將純化的rUreB蛋白加弗氏佐劑經腹腔注射免疫小鼠，可誘導產生高水平的特異性抗體，測得小鼠血清中的IgG抗體水平較對照組相比顯著增加，同樣的結果體現在Zhang等[6]的研究中。隨著研究的深入，研究者們發現將尿素酶和其他能誘導機體產生免疫保護作用的抗原聯合制成二價或多價疫苗，可能會進一步增強疫苗的免疫效果。林煥建等[7]通過UreB和過氧化氫酶加免疫佐劑CT制成二價口服疫苗，獲得了近83.4%的免疫保護率，與單價疫苗組即過氧化氫酶加CT組的41.7%和UreB加CT組的54.2%相比獲得了較為理想的免疫效果，且二價疫苗組中小鼠胃黏膜中HP的定植密度也明顯降低。更多可喜的研究結果體現在Zhou等[8,9]的研究中。

雖然不同地區的HP菌株具有多樣性和易變異等特點，但不同HP菌株間UreB的核酸序列具有高度的保守性和同源性，且分子量大，特異性強，能有效地誘導機體產生穩定的免疫保護作用，與UreA相比，UreB具有更好的免疫保護作用[10]。因此，UreB被列為最有前景的候選抗原之一。

2.2空泡毒素和細胞毒素

2.2.1空泡毒素 空泡毒素相關基因A (Vacuolat-ing cytotoxin gen A，VacA)編碼的VacA蛋白是HP中重要的毒力因子和致病因子。有研究表明，VacA和CagA基因的可變序列可能是HP菌株多樣性和易變異的主要原因。目前，根據VacA和CagA的表達情況，可將HP分為兩類：Ⅰ型(CagA+VacA+)和Ⅱ型(CagA-VacA-)。

VacA是一種約含有860個氨基酸殘基的多功能蛋白，該毒素通過在靶細胞膜上形成小孔，導致細胞中離子和小分子物質泄漏。VacA最重要的生物學作用是誘導宿主細胞的細胞膜孔隙與空泡的形成，誘導上皮細胞空泡樣損傷[11]。Chiozzi等[12]研究表明：VacA可誘發炎癥反應，而VacA與氯化銨聯合作用，在誘發炎癥反應的同時，還可使人胃上皮細胞加速凋亡。Hasanzadeh等[13]將VacA的抗原區克隆到載體PET32a中，并在大腸桿菌BL21中表達目的蛋白，結果表明VacA蛋白不但具有抗原性，且重組VacA蛋白能夠與HP患者血清中IgG特異性識別。由以上結果不難看出VacA作為HP疫苗候選抗原的潛力，并推測VacA可以用于HP診斷試劑和HP疫苗的發展，但VacA單獨作為抗原對小鼠進行攻毒試驗并評價免疫效果的研究很少，一般是與細胞毒素相關基因A或其他抗原聯合應用。

2.2.2細胞毒素 細胞毒素相關基因A(Cytotoxin-associated gen A，CagA)的表達產物CagA蛋白是一種免疫原性較強，存在于菌體表面的外膜蛋白。CagA基因5′端高度保守，不同毒力菌株之間的同源性高達80%以上，可以作為候選抗原刺激機體產生免疫反應，與此相反的CagA基因3′端相對多變，含有不同數量的重復序列。CagA是HP中能增強胃炎、消化性潰瘍的一種重要的毒力因子，還可能是胃上皮細胞癌變的關鍵因素[14]。據早些年研究表明[15]，CagA陽性菌株常見于炎癥較為嚴重或胃癌患者中，這些患者胃上皮細胞中的AP-1和NFKB等轉錄因子活性升高，其激活可導致多種炎癥因子如IFN-γ、IL-2等的表達，從而加劇胃黏膜損傷。再者，T細胞的FasL基因啟動子區域有2個NF-κB和3個AP-1結合位點，CagA可能通過激活轉錄因子增強T細胞FasL基因的表達，損害Fas陽性上皮細胞，促進T細胞間“相互殘殺”。因此以上研究并不支持CagA用于候選抗原的應用。但隨著研究的深入，發現CagA基因完整的DNA序列因其含有非必需表位和較高分子質量，不易克隆和表達。因此，研究者們選擇將CagA部分基因序列與其他抗原聯合，制備二價甚至多價疫苗，并在動物模型中取得了較為可喜的成果，同時開啟了由HP單價疫苗轉向多價疫苗的時代[16,17]。

近些年來，對VacA和CagA的研究僅限于動物模型，鮮有VacA和CagA疫苗進入臨床試驗的相關報道，但對二者的研究熱度并沒有因此而減少。由于多抗原融合疫苗參與發病的不同階段，因而獲得了較為理想的免疫效果，為HP多價疫苗的發展提供一定的理論支持，HP多價疫苗可能是攻克HP感染道路上的成功一步。

2.3黏附素 黏附素(Helicobacter pylori adhesin A，Hpa A)是由Hpa A基因編碼的脂蛋白，不同HP菌株間高度保守，迄今為止，并沒有發現Hpa A陰性菌株。Hpa A介導HP的黏附與定植，具有較好的免疫原性和免疫反應性，但發揮免疫保護作用的關鍵表位和分子機制尚不明確。有研究表明，Hpa A由胞內區、跨膜區、胞外區三個部分組成，其中跨膜區和胞外區發揮免疫保護作用[18]，因此，Flach等[19]利用截短形式的HpaA聯合UreB免疫C57BL/6小鼠，與對照組全長的Hpa A聯合UreB相比較，HP特異性抗體IgG的滴度顯著升高。近期，Tobias等[20]構建重組無毒的霍亂弧菌，將Hpa A和產腸毒素大腸桿菌定植因子(CFA/I)共表達(VC-HpaA-CFA/I)，發現與VC-HpaA相比，Hpa A水平在重組菌株VC-HpaA-CFA/I中的表達量更高，理論上，此種疫苗可以對抗包括大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、霍亂弧菌在內的三種病原體，可能成為抗HP感染的潛在候選疫苗，為今后研制對抗多種病原體疫苗提供更多的理論支持，但此疫苗的安全性有待進一步評估。

2.4過氧化氫酶 過氧化氫酶(Catalase，KatA)是一種高度保守，暴露于菌體表面的蛋白酶，約占HP菌體蛋白的1.5%左右。在功能上KatA與Urase似乎有著異曲同工之妙，KatA通過將有毒的代謝產物轉化成水，保證代謝平衡的同時，保護HP免受中性粒細胞殺傷，是HP逃避宿主免疫的重要組成部分。同時KatA在pH<3的環境中仍可保持活性，是HP在胃黏膜極酸環境中得以定植和生存的關鍵。近些年，關于KatA表位疫苗的研究較多，并證實含有較少氨基酸序列的KatA表位疫苗等同甚至優于KatA全序列疫苗[21,22]。隨著研究的深入，KatA抗原與疾病的關聯程度備受關注，尤其是在胃癌中。有研究表明[23]，較高的KatA抗體滴度在一定程度上可以預防胃癌的發生，并可以作為胃癌篩選的生物標志物。經查閱文獻可以看出，在2010年甚至更早以前涌現了大量關于證實KatA免疫原性的研究[24,25]，為KatA作為HP疫苗候選抗原、KatA聯合其他抗原、KatA表位疫苗的發展提供理論依據。雖然表位疫苗的表位識別和正確組裝技術尚不成熟，表位之間的相互影響仍需探索，但KatA表位疫苗已經展現了不俗的發展前景，這為探究HP疫苗的大方向奠定基礎。

2.5膜炎性蛋白 膜炎性蛋白(Outer inflammatory protrin,OipA)由hopH基因編碼，相對分子質量約34 kD。關于OipA與臨床疾病的關系尚無統一定論，有研究發現，在胃潰瘍患者中OipA+HP的總檢出率高達100%，顯著高于胃炎患者26.2%的檢出率。相似的結果也體現在Markovska等[26]的研究中，OipA幾乎表達于從消化性潰瘍患者分離的所有菌株中(97%)，在胃炎患者中分離的菌株中較少(66%)。但在最近的研究卻展現相反的結果，OipA與胃部疾病無關聯，不能作為預測診斷胃腸疾病的標志[27]。

目前，對于OipA能否直接影響促炎性信號還存在爭議，有研究表明，功能性的hopH基因失活導致IL-8分泌減少50%左右，因此功能性的OipA在IL-8的誘導中起著重要作用。與此相反，在Dossumbekova等[28]的研究中發現hopH基因表達與IL-8分泌并沒有相關性。出現上述兩種結果的原因可能是菌種的區域性差異，因此，不同地理區域的臨床報告預測毒力因子與疾病的發生結果是有爭議的。

2.6十二指腸潰瘍促進因子 DupA(Duodenal ulcer promoting gene，DupA)被稱為十二指腸潰瘍促進因子，因常見于十二指腸潰瘍患者中而得名。DupA是近些年研究的熱門，因此，圍繞DupA的相關研究并不完善，研究結果不盡相同甚至相反。有研究表明[29]，不同區域DupA陽性檢出率不同，且與臨床疾病無顯著相關性，該研究還發現，DupA的存在與否與HP的其他毒力因子無關。同年Shiota等[30]表明，DupA與十二指腸潰瘍密切相關，但與胃癌的關系尚不明確。近年來Souod等[27]通過研究DupA、OipA與胃部疾病的關系中指出，DupA可以作為預測十二指腸潰瘍的標志物和胃癌的抑制因子，同時發現HP中的一些毒力因子并不單獨存在，而是與其他毒力因子聯合形成“協同活性”，此研究結果與Shiota等[30]完全相反。最近，在探索HP中毒力因子與胃部疾病的關聯性發現，HP中的毒力因子之間存在關聯性(VacA、CagA、DupA、OipA)，這種關聯性與胃部疾病聯系緊密，特別是胃炎[31]。以上種種結果不難看出，雖然圍繞DupA的相關研究日漸廣泛，但關于DupA與臨床疾病的關聯性尚無統一定論，且目前并沒有關于DupA作為候選抗原制成HP疫苗的相關報道。

2.7脂多糖 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是重要的毒力因子，被認為是引起黏膜炎癥反應的一種強效內毒素，介導多種細胞因子和趨化因子的釋放，從而誘導免疫反應的發生[32]。LPS主要表達LewisX和LewisY抗原決定簇，HP患者產生Lewis抗原決定簇抗體并通過自身免疫反應造成胃黏膜損傷和潰瘍創面形成[33]。此外LPS促進Th1型免疫應答反應，并在受試小鼠體內檢測到細胞因子IFN-γ增加，這可能是消除HP感染的關鍵[34]。在對此種抗原的學習和查閱文獻中發現，LPS的研究現狀處于探究其生物活性，評價免疫原性階段，且對其引起免疫應答的類型處于研究探索中，因此，尚且沒有LPS作為抗原或與其他抗原聯合制備HP疫苗的相關報道。

3 前景展望

除上述幾種抗原外，中性粒細胞激活蛋白(Nap)[35,36]、熱休克蛋白(Hsp)[37,38]都有作為候選抗原的相關報道，在這里不再一一概述。就HP疫苗的研究現狀而言，HP疫苗仍處于實驗階段，現階段的研究成果尚不能完全清除體內感染和阻斷HP傳播，且保護率不高的問題在國內外一直未有突破。目前為止，尚且沒有HP疫苗進入臨床的相關報道，因此，現階段的治療方式仍以抗生素治療為主，但抗生素耐藥性(克拉霉素)成為應用抗生素治療失敗的主要原因[39]，基于目前理論研究成果，推薦使用益生菌[40,41]和中藥制劑作為輔助治療。

HP疫苗的研究尚存在許多問題，但取得的成果不容忽視，Naz等[42]基于反向疫苗學方法預測HP疫苗的潛在候選抗原，并預測VacA、BabA、Hpa A等是首要候選抗原。現如今，大部分的臨床研究已經運用重組尿素酶作為抗原。或許研究不同抗原組合的多價疫苗、篩選高效抗原并增加抗原的表達量、探索HP表位疫苗中表位結合的新型方式是HP疫苗未來的發展方向。隨著生物學、信息科學技術的不斷發展和完善，HP疫苗的研制必將取得成功。

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