MicroRNAs與心力衰竭的研究進展

徐曼曼，張久亮，范書英

心力衰竭一種由心臟結構和功能紊亂引起的復雜臨床綜合征，其是世界范圍內危及生命的疾病［1］，嚴重影響人們的生活質量，包括呼吸困難、疲勞、運動耐量差和液體潴留。心力衰竭的發病原因包括性別、年齡、種族、合并癥和環境等因素，近年來發展的心肌血運重建治療降低了急性心肌梗死（AMI）患者突然死亡的發生率，但AMI發展成心力衰竭的數量穩步增加［2］。據估計，全球心力衰竭患者超過3 770萬人，且每年有87萬人被新診斷為心力衰竭［3］，盡管藥物治療和技術設備也取得了飛速的發展，但仍有約50%的心力衰竭患者在5年內死亡［4］。在美國，2030年心力衰竭患者的總醫療費用預計將從2012年的209億美元上升到531億美元［5］。如今，心力衰竭診治仍是世界性的難題。如何通過早期診斷、早期治療來控制和延緩心力衰竭病情發展，提高患者的生活質量成為當務之急。

MicroRNAs（miRNAs）在心力衰竭中的調控機制成為當前研究的熱點之一，隨著研究深入，miRNAs家族中眾多miRNA被證明在心力衰竭發展過程中起到了重要作用［6］。miRNAs在心力衰竭的診斷、治療和預后中的作用為臨床提供了一條新的思路，有望成為新的生物學標志物，用于心力衰竭的早期診斷和治療。

1 miRNAs和心力衰竭

1.1 miRNAs 生成成熟的miRNAs是一個單鏈小分子（19～23個核酸片段）內源性非編碼RNA，其轉錄后可水平調控基因表達，廣泛存在于動植物中。miRNAs的生成過程非常復雜，初始miRNA是在內轉子或基因間區內，通過RNA酶Ⅱ轉錄形成，長度為1～3 kb。而后，初始miRNAs在細胞核內由RNA酶Ⅲ Drosha和雙鏈RNA結合蛋白質Pasha作用下，形成莖環狀結構的前體miRNAs（pre-miRNAs），長度為70～100個核苷酸。Pre-miRNAs在Exportin-5作用下，從細胞核轉移到細胞質中，并在RNAs酶ⅢDicer酶作用下，裂解成為長度為18～24的雙鏈寡核苷酸——成熟雙鏈miRNA。成熟miRNA參與一系列的生命進程，并且調控各個階段的基因表達，與多種心血管疾病的發病機制密切相關。

1.2 心臟重塑與心力衰竭 心力衰竭是各種心臟病發生發展的終末節段，心臟重塑是其發生和發展的基本機制。心臟重塑是心肌對各種外部刺激的一個自適應性改變過程，以維持心臟功能及外部刺激下的血流動力學平衡。當外部刺激持續存在時，心臟重塑就變成了一個不可逆的過程，并逐步惡化，最后導致心臟衰竭。

心臟重塑的3個主要特征包括過度的心臟細胞外基質纖維化、病理性心肌細胞肥大以及心肌細胞凋亡。

正常的心肌細胞被膠原纖維網包圍，其中成纖維細胞分泌細胞外基質蛋白，以應對病理壓力或心肌梗死。但是過度的細胞外基質蛋白分泌將導致心肌纖維化，引起機械僵硬，產生收縮性功能紊亂［7］。心肌細胞肥大是在多種病理狀態下形成的，比如慢性超載、缺血性損傷和神經內分泌失衡。早期心肌細胞肥大是一個自適應性過程，主要是在應激狀態下通過增強心肌壁的張力和收縮來保證心臟的排血功能，但是這種過程終會導致心肌細胞死亡。因此，病理性的心肌細胞肥大是心力衰竭的獨立危險因素且多提示預后不良。心肌細胞的凋亡可通過多種通路發生，是細胞的程序性凋亡，可導致心肌細胞的大量喪失，從而加速心力衰竭的進程［8］。

2 心力衰竭相關的miRNAs

自2006年miRNAs與心力衰竭的關系首次被報道以來［9］，miRNAs家族中大量miRNA被證明在心力衰竭發展過程中起到重要作用，例如miRNA-21、miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208、miRNA-499等。

2.1 miRNA-21 THUM 等［10］研究表明，在心力衰竭小鼠模型的心肌細胞中，與其他心臟細胞類型相比，miRNA-21選擇性的在成纖維細胞中有較高表達水平。miRNA-21可通過抑制Spry1，使ERK-MAP激酶活性增加，從而調節成纖維細胞的生長和生長因子的分泌，促進心肌纖維化和肥大［11］。miRNA-21受多個調節因素的影響。YANG等［11］證明抑制轉化生長因子β（TGF-β）信號通路和抑制前纖維化的miRNA-21，可增強磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路，以防止心肌纖維化。而過度表達的TGF-β可以抑制miRNA-21表達，減少心肌纖維化中膠原蛋白的產生［12］。miRNA-21也可由血管緊張素Ⅱ誘導，促進心肌纖維化的發生。另一方面，寡核苷酸介導的miRNA-21抑制可通過增加目標PTEN和SMAD7（均是心肌纖維化中的基因）以阻止心肌纖維化發展［13］。

miRNA-21可通過抑制PDCD4的表達來減緩心肌細胞的凋亡，HUANG等［14］研究表明miRNA-21的過表達可顯著地抑制細胞自噬活性并且減少細胞凋亡，主要針對部分由蛋白激酶B（AKT）/mTOR通路激活并介導的路徑。DONG等［15］研究也表明miRNA-21可以通過調控抗凋亡基因B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）的表達抑制心肌細胞凋亡。HUANG等［16］發現在心肌細胞缺血、低氧條件下，miRNA-21和miRNA-146a在協同作用下可以更有效地發揮抑制心肌細胞凋亡的作用。

心房纖維化是心房顫動（簡稱房顫）結構重構的標志，也是心律失常維持和惡化的結構基礎。研究顯示，miRNA-21與心律失常有關［17］。研究發現，在心肌梗死小鼠心房組織中，隨著靶基因Sprouty-1、重組人膠原蛋白1、膠原蛋白3的表達異常，miRNA-21的表達出現上調，可介導心房纖維化［15］。HUANG等［16］發現，miRNA-21可特異性降解Smad7，并降低Smad7對TGF-β1/SMAD信號通路的抑制性反饋調節，而下調Smad7也會促進心房纖維化的發展，從而成為房顫患者心房纖維化的新機制。以上結果表明，miRNA-21可能代表一個潛在的治療靶點。

2.2 miRNA-1 miRNA-1專門表達心肌，是最豐富的心臟miRNAs之一，參與心臟的病理生理過程。miRNA-1缺少可引起嚴重的心臟缺陷。

miRNA-1可以通過NFAT信號通路影響心肌細胞生長，對鈣調蛋白和鈣調蛋白依賴的核因子的表達進行負調節。除了針對鈣調蛋白，在心肌細胞生長過程中，miRNA-1還作用于數個重要基因轉錄因子的非翻譯區，包括肌細胞增強因子（Mef2a）和GATA結合蛋白4（Gata4），也作用于其他轉錄因子，如Notch配體、Twf1、G3bp1 和 Hand2［18］。

腺病毒誘導的miRNA-1的過表達導致Mef2a和Gata4表達下調，而敲除miRNA-1基因后，上述因子表達上調［19］。研究表明，miRNA-1可以阻止心肌細胞肥大的進展，主要是通過抑制Hand2蛋白、拮抗GF-1和細胞外基質重塑因子——雙解絲蛋白1（Twf1）的活性來實現［20］。另外，有研究發現GTP酶激活蛋白結合蛋白1（G3bp1）在心肌細胞肥大中是上調的，可以通過綁定的公式序列pre-miRNA-1-2莖環結構來限制miRNA-1的表達進程［20-21］。G3bp1具有下調成熟miRNA-1的作用，在心臟肥大發生過程中，用于抑制靶向目標和增強相關基因表達。研究顯示，向左心室肥大（由壓力超負荷誘導）的小鼠中靜脈注射類miRNA-1物質可以減慢心肌纖維化、心臟肥大和心肌細胞凋亡的進展，并且可以改善鈣信號［20］，這說明miRNA-1在心肌細胞肥大的進程中扮演著重要角色，且該進程可以被類miRNA-1物質所逆轉。

2.3 miRNA-133 miRNA-133同 miRNA-1一樣存在于同樣的轉錄單元中，大量存在于心肌細胞中。不管是在動物模型還是人體試驗中，miRNA-133均被認為是心臟肥大的調節器，并發現其在心力衰竭和心臟肥大中低表達［22］。基于分子水平的研究顯示，miRNA-133可作用于多個抗心臟肥大基因［23］。MATKOVICH等［24］觀察到穩定的miRNA-133水平可以減少心肌纖維化、改善心臟的舒張功能，并且抑制心臟肥大的進展，得出在轉基因小鼠中miRNA-133具有保護心肌的作用。研究顯示，miRNA-133的低表達可以加速糖尿病合并心臟病患者心肌肥大的形成，而其過表達則對糖尿病患者的心肌纖維化有拮抗作用［25］。DINIZ等［26］研究表明在由甲狀腺激素誘導產生的心肌細胞肥大中，miRNA-133的表達是降低的，并且miRNA-133類似物可以在體外應對三碘甲狀腺原氨酸（T3）以阻止心肌細胞肥大的進一步發展。而另一項研究則是由腺病毒所誘導miRNA-133過量表達，發現miRNA-133a在Akt通路中具有監管作用，并且可以通過激活Akt通路來減少心肌細胞肥大的發生，表明在心力衰竭小鼠中模擬miRNA-133a對心臟功能產生了積極作用［27］。

總之，miRNA-133的高表達可抑制心肌細胞凋亡起到保護心肌的作用。在單個miRNA-1或miRNA-133集群基因敲除的小鼠中，可在心肌細胞中發現心室動作電位的延長，表明其對正常心臟電生理學的調節至關重要［28］。功能獲得性研究證實，誘導miRNA-133特異性表達可以減少心肌細胞凋亡和膠原沉積，并且促進慢性壓力超負荷后心功能恢復［29］。miRNA-133還可以對Casp3、Casp8進行反向調控并且保護心肌細胞免受氧化應激引起的細胞凋亡［29］。

2.4 miRNA-208 miRNA-208家 族 由 miRNA-208a、miRNA-208b和miRNA-499組成，其編碼基因分別位于(Myh)6/a組織相容性復合體（MHC）、Myh7/βMHC、Myh7b的內含子內，在調節肌肉肌凝蛋白含量、肌纖維的屬性和肌肉性能方面發揮重要作用［30］。眾所周知，對于miRNAs來說，組織和細胞的特異性至關重要，通過實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析各種器官中的miRNAs含量，包括心、腦、腎、肺、肝和骨骼肌，發現miRNA-208a只在心臟中表達，但是miRNA-208b和miRNA-499在胚胎期的心臟和骨骼肌中均有表達［31］。miRNA-208a和miRNA-208b的過表達可以導致這些基因轉錄后抑制，包括與腫瘤壞死因子（TNF）受體相關聯的蛋白1（Trap1）、肌肉生長抑制素（MSTN）以及轉錄因子Gata4，表明miRNA-208家族參與心肌肌凝蛋白的形成和血清效應因子依賴的啟動子區域的轉錄基因的激活。miRNA-208基因敲除小鼠通過減弱同源域蛋白質和心肌細胞連接蛋白Cx-40的表達，可以導致心臟傳導缺陷，說明miRNA-208a也是傳導系統發育過程中的重要因子［31］。目前為止，許多研究顯示miRNA-208家族的異位表達與心血管疾病的發生和發展密切相關，HUANG等［32］認為miRNA-208a的表達水平與受SRYBox6（SOX6）負調控的心肌細胞相關聯，心臟特異性miRNA-208a超表達足以引起心臟肥大小鼠的心律失常，且miRNA-208a在患者外周血中表達水平的上升還會增加心臟肥大的發生風險［33］。在Dahl高血壓小鼠實驗中，miRNA-208a水平的抑制不僅可以阻止病理性肌凝蛋白的轉換，還可以提高心臟功能和生存率［34］。

2.5 miRNA-499 miRNA-499也在心肌細胞中大量存在，miRNA-499與miRNA-208含有共同的mRNA靶基因，并且其中一些靶基因也與miRNA-1的靶基因相重疊，均與心肌分化有關［35］。在小鼠和人類胚胎干細胞培養中，miRNA-499的消融可以阻止心肌細胞的分化，但是miRNA-499的過表達卻可以促進擬胚體集群的早期形成，表明其可以增強肌原性分化［36］。miRNA-499的目標基因是鈣調磷酸酶基因（CnA），與線粒體裂變和細胞凋亡相關。CHUA等［37］研究表明miRNA-499通過控制含有CnA和發動蛋白相關性蛋白1（Drp1）的凋亡通道，調控PDCD4以抑制心力衰竭時的心肌細胞凋亡。

3 miRNAs與心力衰竭的診斷、預后與治療

盡管目前腦鈉肽（BNP）和N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）被視為心力衰竭的首選標志物，但是越來越多的研究證實miRNAs可作為潛在的生物學標志物［38］。在心力衰竭的診斷中，BNP靈敏度高，但特異度差，且某些心肺疾病、腎衰竭、肝硬化等也可以使血漿BNP水平升高。此外BNP水平還可受到年齡、性別、體質指數等因素的影響。

大多數miRNAs具有診斷價值，但很少有預后價值，換言之，這些miRNAs可以從一組呼吸困難患者中識別出心力衰竭患者，或將其與健康對照組區分開來，但很少能預測出不利的預后情況。近年來的研究發現miR-423-5p具有很高的潛在診斷價值［39］。TIJSEN等［40］通過miRNA芯片技術觀察12例正常人和12例心力衰竭患者，發現miR-423-5p特異性的廣泛存在于心力衰竭患者中，并且在50例原因不明的呼吸困難患者中，根據miR-423-5p水平準確地分辨出其中30例心力衰竭患者。此外，DUYGU等［38］在30例慢性穩定型心力衰竭患者與30例健康門診對照者的研究中也證實了miR-423-5p的診斷價值；miR-423-5p可聯合升高的miR-320a、miR-22和miR-92b來診斷心力衰竭患者，其靈敏度和特異度均可達90%；此外，上述4種miRNAs也與升高的BNP水平、寬QRS波群、增加的左心室舒張末期內徑（LVEDD）和增加的左心室直徑（LAD）呈明顯的相關性。另外，其他miRNAs對心力衰竭的診斷也存在一定價值，CHEN等［25］、DUYGU等［38］發現在不同呼吸困難患者中，miRNAs存在差異性表達，并且與NT-proBNP和肌鈣蛋白相比較，確定miR-103、miR-142-3p、miR-23a、miR-27b、miR-324-5p、miR-342-3p與心力衰竭的診斷具有相關性，其中3種（miR-103、miR-142-3p、miR-342-3p）和 miR-30b在心力衰竭患者組、對照組、慢性阻塞性肺疾病（COPD）組和其他呼吸困難疾病組之間有差異性表達。與NT-proBNP相比，雖然以上單個miRNA診斷心力衰竭的靈敏度和特異度均較低，但與NT-proBNP聯合應用可增加診斷心力衰竭的準確性［41］。另外有研究確定了8種miRNAs（miR-558、miR-122、miR-520d-5p、miR-200b、miR-622、miR-519e、miR-1231、miR-1228）聯合應用在識別心力衰竭患者時表現出較高的精確度、特異度和靈敏度，其中miR-520d-5p、miR-558、miR-122具有最高的統計學意義。miR-622、miR-520d-5p、miR-519e、miR-200b與左心室功能的惡化也有較大相關性，但以上miRNAs沒有任何一種被證實與美國紐約心臟病學會（NYHA）心功能分級具有相關性［42］。但是FUKUSHIMA等［43］發現在心力衰竭患者中，miRNA-126的血漿濃度與NT-proBNP呈負相關，還發現miRNA-126的血漿濃度隨著NYHA心功能分級的改善（Ⅳ-Ⅲ）而升高，證明其與NYHA心功能分級具有相關性。

一些急性心肌損傷，例如心肌梗死的出現可能會削弱miRNAs對心力衰竭的診斷價值。BAUTERS等［44］從WILSON等［35］和DUYGU等［38］的大型研究中篩選心力衰竭患者，這些患者均是因心肌梗死住院（Killip分級＞2），在對這246例心肌梗死患者的隨訪中，進一步的證實miR-423-5p與不良左心室重構程度沒有明顯的相關性。

2013年MATSUMOTO等［45］第一次證實了miRNAs可能也具有預測心力衰竭患者的預后價值，其研究了心肌梗死1年后發展為心力衰竭的患者的miRNAs，并將其與1年內沒有發生心力衰竭的患者的miRNAs譜進行比較，發現miR-192、miR-194、miR-34a在心力衰竭急性期的表達水平與急性心肌梗死1年內心力衰竭發生率顯著相關。而后，CAKMAK等［46］也證實了miR-182的預后價值，其調查了20例臨床穩定型心力衰竭患者（NYHA Ⅱ），22例失代償心力衰竭患者（NYHAⅢ級和Ⅳ級）和15例健康對照者，發現在慢性心力衰竭患者中，部分miRNAs水平升高（miR-21、miR-650、miR-744、miR-516-5p、miR-1292、miR-182、miR-1228、miR-595、miR-663b、miR-1296、miR-1825、miR-299-3p、miR-662、miR-122、miR-3148、miR-518e），而部分miRNAs水平降低（miR-129-3p、miR-3155、miR-3175、miR-583、miR-568、miR-30d、miR-200a、miR-1979、miR-371-3p、miR-155、miR-502-5P）；此外，在6個月隨訪中，其發現miR-182預測心血管病死率優于NT-proBNP和C反應蛋白（CRP）［46］。然而，沒有一個標志物能夠預測繼發性臨床終點，如住院失代償性心力衰竭或室性心律失常。

目前臨床基于miRNAs的治療方法主要有2種：miRNAs抑制劑和miRNAs類似物，這2種方法的目的均是使機體內異常表達的miRNAs恢復正常，即沉默過度表達的miRNAs或交替缺失的miRNAs。miRNAs拮抗劑是一類人工合成的單鏈寡核苷酸，能夠與特異性成熟的miRNAs相匹配，在局部或者全身發揮作用，miRNAs拮抗劑進入細胞質，與靶miRNAs特異性結合并產生降解作用。THUM等［47］應用一個特定的miRNA-21干預治療（miRNA-21主要在心肌的成纖維細胞中過表達）通過增加后負荷誘導的小鼠心臟肥大模型，發現心臟肥大和心肌纖維化被明顯逆轉，并且減緩了心功能的惡化。MONTGOMERY等［48］在心肌肥厚誘導的心力衰竭模型中，應用miRNA-208a拮抗劑抑制其表達，發現miRNA-208a表達的抑制可避免心室重構和肌凝蛋白的病理改變，從而改善心功能。以上研究均證實miRNAs拮抗劑能有效逆轉心肌肥厚，但迄今為止大多數研究僅對一個miRNA沉默，而多個miRNAs參與心室重構過程，因此拮抗多個miRNAs后可能獲得更好的療效。

miRNAs類似物是一類人工制造的類似前體miRNA的雙鏈寡核苷酸，當其進入細胞時被miRNAs生物合成機制所識別。隨后，miRNAs類似物被Dicer酶作用替代內源性miRNAs。但是在miRNAs替代療法中首先要確保組織的特異性，如果不能得到保證，miRNAs替代療法將觸發正常組織中的miRNAs的異常變化，從而引起一系列的不良反應。因此，一個復雜的運輸系統是實現這種療法的前提，目前病毒載體被認為是一個很有潛力的運輸系統［38］，這些載體主要源于病毒家族的致病病毒和具有高親和力的心肌細胞。SUCKAU等［49］通過增加后負荷來制造心力衰竭小鼠模型，應用病毒載體進行miRNAs模擬療法，結果表明其可以改善心肌纖維化和心室肥厚。

4 小結與展望

近年來，miRNAs引起了越來越多的關注，盡管對于其的起源和作用機制尚有許多不確定因素，但越來越多的研究對于其的轉運功能和作用機制進行了探究，并為今后的臨床應用提供了重要線索。數個miRNAs已經確定參與心力衰竭發生、發展，例如參與心臟肥大、纖維化和凋亡機制，是一類很有前景的新的生物學標志物，同時也增加了人們對心力衰竭更深層面的病理生理學認識。此外，在對心力衰竭的診斷和治療方面，miRNAs可能是心力衰竭臨床診斷、治療干預甚至預后評估的一種新工具和新手段。或許在不久的將來，以miRNAs介導的預防、診斷和治療心力衰竭將成為現實，以miRNAs為靶點設計的新藥物將為心血管疾病的治療打開新篇章。

作者貢獻：范書英進行文章的構思與設計；徐曼曼、范書英負責撰寫論文、修訂論文；徐曼曼、張久亮、范書英負責文章的質量控制及審校；張久亮、范書英對文章整體負責，并進行監督管理。

本文無利益沖突。

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