急腹癥Ⅲ號對呼吸機相關性肺炎大鼠腸道通透性及細菌移位的影響

王瑞明

[摘要] 目的 觀察急腹癥Ⅲ號對呼吸機相關性肺炎模型大鼠腸黏膜屏障的影響，并探討其作用機制。 方法 選擇清潔型雄性SD大鼠100只，隨機分為5組。急腹癥Ⅲ號組：VAP（呼吸機相關性肺炎）模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號2 mL；谷氨酰胺組：VAP模型，每日灌胃谷氨酰胺顆粒2 mL；急腹癥Ⅲ號聯合谷氨酰胺組：VAP模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺顆粒各2 mL；安慰劑組：VAP模型，每日灌胃生理鹽水2 mL；空白對照組：無特殊處理，每日灌胃生理鹽水2 mL。術后第5天收集尿液，采用乳果糖/甘露醇法評價腸黏膜通透性，第6天處死大鼠取腸系膜淋巴結進行培養。 結果 腸道通透性方面，安慰劑組較空白對照組L/M（乳果糖/甘露醇）明顯增大（P<0.05），其余三個干預組與空白對照組相似，急腹癥Ⅲ號組L/M大于谷氨酰胺組，但差異無統計學意義。細菌移位方面，安慰劑組明顯高于空白對照組（P<0.01），其余三組陽性率均低于安慰劑組（P<0.05）。培養結果主要為腸道寄生菌（大腸桿菌為主）。 結論 呼吸機相關性肺炎模型破壞了大鼠的小腸黏膜結構并增加了腸道通透性，出現腸道細菌移位。院內制劑急腹癥Ⅲ號可使腸黏膜通透性減小，促進腸黏膜結構修復，減少腸道菌群移位。谷氨酰胺和急腹癥Ⅲ號聯合使用對腸道黏膜結構保護作用并沒有更加明顯。

[關鍵詞] 急腹癥Ⅲ號；呼吸機相關性肺炎；腸道通透性；細菌移位

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）34-0020-04

Effect of acute abdomen Ⅲ on intestinal permeability and bacterial translocation in ventilator-associated pneumonia rats

WANG Ruiming

Department of Emergency Medicine， Hangzhou Traditional Chinese Medicine Hospital， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To observe the effect of acute abdomen Ⅲ on intestinal mucosal barrier in ventilator-associated pneumonia model rats and to explore its mechanism. Methods A total of 100 clean male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups. The acute abdomen group Ⅲ group： VAP（ventilator-associated pneumonia） model， daily gavage of acute abdomen Ⅲ 2 mL； glutamine group： VAP model， daily gavage of glutamine particles 2 mL； acute abdomen Ⅲ combined with glutamine group： VAP model， daily gavage of acute abdomen Ⅲ 2 mL and glutamine particles 2 mL； placebo group： VAP model， daily intake of saline 2 mL； blank control group： No special treatment， daily gavage of saline 2 mL. The urine was collected on the fifth day after operation. The permeability of intestinal mucosa was evaluated by lactulose/mannitol method. The rats were sacrificed on the 6th day and mesenteric lymph nodes were cultured. Results The intestinal permeability of the placebo group was significantly higher than that of the blank control group L/M （lactulose/mannitol）（P<0.05）. And the intestinal permeability of the other three intervention groups was similar to that of the blank control group. And L/M in the acute abdomen Ⅲ group was higher than that of the glutamine group， but there was no significant difference. The placebo group had significantly higher bacterial translocation than that of the blank control group（P<0.01）. The positive rate of bacterial translocation in the remaining three groups was lower than that of the placebo group（P<0.05）. The culture results were mainly intestinal parasites （Escherichia coli）. Conclusion Ventilator-associated pneumonia model destroys the intestinal mucosa of rats and increases intestinal permeability， resulting in intestinal bacterial translocation. In-hospital preparation of acute abdomen Ⅲ can reduce intestinal mucosal permeability， promote intestinal mucosal repair and can reduce intestinal bacterial translocation. The combination use of Glutamine and acute abdomen Ⅲ has no more obvious protection role in intestinal mucosal structure.endprint

[Key words] Acute abdomen Ⅲ； Ventilator-associated pneumonia； Intestinal permeability； Bacterial translocation

腸道被認為是危重病應激的“中心器官”和MODS的“始動器”[1]。腸道黏膜屏障是人體抵御外界細菌入侵的重要屏障，但因其本身存在大量細菌，所以又極其容易受到損傷。人體在各種應激狀態下，如缺氧、嚴重感染等，可以出現腸道黏膜屏障的改變，通透性增高，免疫功能受到抑制，腸道菌群出現移位，甚至發展為多器官功能障礙綜合征（MODS）。呼吸機相關性肺炎也不例外。本實驗研究院內制劑急腹癥Ⅲ號對呼吸機相關性肺炎腸道黏膜屏障和腸道菌群移位的影響，并探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 100只體重280～320 g的清潔型雄性SD大鼠（上海西普爾必凱實驗動物有限公司生產，生產批號：SCXK（滬）2013-0016。實驗動物使用許可證號：浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，SYXK（浙）2013-0184）。

1.1.2 實驗設備 光學顯微鏡Olympus（日本），石蠟切片機RM2135型（德國），低溫高速離心機Beckman（德國），SX-300S凝膠圖像分析處理系統（上海小源科技有限公司），高效液相色譜儀（美國water公司），精密電子天平（Sartorius公司），電泳儀（Bio-RAD公司），代謝籠等。

1.1.3 實驗藥品及試劑 （1）急腹癥Ⅲ號（其基本成分為生大黃、川樸、枳殼、丹參、川芎、生山梔、蒲公英），由杭州市中醫院制劑室提供（批準文號：浙藥制字Z20100112），150 mg/（kg·次）。（2）谷氨酰胺（日本壽制藥株式會社）：等氮量的谷氨酰胺0.3 g/kg每日灌胃。（3）乳果糖標準品（上海源葉生物科技有限公司）和甘露醇標準品（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 造模方法

1.2.1 大鼠呼吸機相關性肺炎模型建立[2] （1）經口氣管插管：用16和18號靜脈套管針制備氣管導管。大鼠麻醉前禁食12 h。用質量分數20%的烏拉坦腹腔注射麻醉，用消毒小紗布將舌向左外側上方輕輕拉出，頭部盡量向上抬起，同時上下頜分開。在額戴式喉鏡反射光照射下對準聲門旋轉插入自制氣管導管，插入深度為套管針尾部與牙齒平齊。觀察棉絮在氣管導管口的起伏并用聽診器聽雙肺呼吸音以確定導管在氣管內，將氣管導管外層與大鼠上唇縫合固定，連接動物呼吸機控制呼吸。呼吸機參數設定為：潮氣量（V）12 mL/kg，呼吸頻率70次/min，吸入氧濃度 （FiO2）1.0。為防止體位引起的肺不張，每隔30 min行2～3次大V通氣。股靜脈插管，以3～5 mL/h輸入質量分數為5%的葡萄糖鹽水。（2）大鼠VAP模型制備：每只大鼠機械通氣24 h（無需使用肌松劑）后，豎起固定板>45°，以微量注射器快速注入0.2 mL 3×108 cfu/L銅綠假單胞菌（PA）菌液和0.55 mL氣體，并保持體位5 min。

1.2.2 造模成功的標準[2] （1）出現肺炎臨床表現。（2）肉眼觀察大鼠肺葉，可見不同程度的融合性出血性病灶。（3）大鼠肺組織光鏡下觀察呈小葉性肺炎特征。（4）外周血和肺泡灌洗液（BALF）細菌學培養陽性。

1.3 給藥方法

將雄性SD大鼠隨機分為5組。（1）急腹癥Ⅲ號組：大鼠VAP模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號2 mL×5 d。（2）谷氨酰胺組：大鼠VAP模型，每日灌胃谷氨酰胺顆粒2 mL×5 d。（3）急腹癥Ⅲ號聯合谷氨酰胺組：大鼠VAP模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺顆粒各2 mL×5 d。（4）安慰劑組：大鼠VAP模型，每日灌胃生理鹽水2 mL×5 d。（5）空白對照組：無特殊處理，每日灌胃生理鹽水2 mL×5 d。

1.4 檢測項目及方法

1.4.1 腸道通透性 術后第5 d，經口灌胃乳果糖+甘露醇混合液2 mL，轉代謝籠收集24 h尿液。取10 mL尿液加硫柳汞2 mL 置-20℃冰箱保存。用HS色譜工作站對色譜圖形進行積分處理。根據標準曲線計算公式算出標本中甘露醇及乳果糖濃度，從而計算得出L/M。

1.4.2 腸系膜淋巴結培養 術后第6天處死大鼠，在無菌條件下取數枚腸系膜根部淋巴結，經碾磨后置37℃培養箱孵育48 h后鑒定菌種及統計菌落計數。菌落數超過100/g組織為細菌移位陽性。

1.5 統計學方法

使用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示。腸道細菌移位分析（計數資料）采用χ2檢驗進行組間比較，通透性檢測用單因素方差分析及Dunnetts法進行兩兩比較，組間數據比較采取方差分析，治療前后比較采取自身對照t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠L/M比較的單因素方差分析

單因素方差分析結果表示，五組術后第5天24 h尿液L/M不全相同（F=19.43，P<0.01）（表1）。進一步采用Dunnetts法進行兩兩比較，結果顯示，安慰劑組L/M高于空白對照組（P<0.05），其余三組則與空白對照組相似，均低于安慰劑組（P<0.01）（表1）。

2.2各組陽性率與安慰劑組的比較

組織培養：細菌培養陽性率見表2，采用χ2檢驗進行組間比較，安慰劑組明顯高于空白對照組（P<0.01），其余三組陽性率均低于安慰劑組（P<0.05）。培養結果主要為大腸桿菌為主的腸道寄生菌。

3 討論

隨著現代醫學的發展，人們逐漸認識到胃腸道參與了許多危重病病理生理過程，是嚴重創傷、休克等等“二次打擊”的發生的誘因和參與者。腸道通透性與危重癥病情呈正相關，病情越重，腸道通透性越高，而通透性增高又加重病情[3]。腸道通透性增加后，內毒素及細菌就可通過受損的腸黏膜屏障而導致細菌移位。Berg RD和Garlinton AW[4]定義細菌移位：胃腸道內寄生菌通過某些通道進入正常無菌組織，如腸系膜淋巴結和其他臟器，事實上移位應包括所有有活力和無活力的微生物及其產物如內毒素等。促使細菌移位的機制[5]：（1）腸黏膜屏障的損傷和萎縮；（2）機體免疫功能的下降；（3）腸道菌群失調引起細菌過度增殖。研究表明，腸道通透性改變可準確反映腸黏膜的損害。腸道通透性與腸屏障有關，而腸屏障又可從腸黏膜形態的變化來判斷其損害的情況。故腸道通透性增高可反映早期腸屏障的損傷。呼吸機相關性肺炎也是如此，本實驗通過監測實驗大鼠尿液中L/M、腸系膜淋巴結培養來判斷其腸黏膜損傷的情況。endprint

急腹癥Ⅲ號是我院院內制劑，其基本成分為生大黃、川樸、枳殼、丹參、川芎、生山梔、蒲公英等。主要是根據《傷寒論》大承氣湯加減化裁而成，具有泄熱通腑，清熱解毒等功效，臨床上多應用于熱瘀所致的腑實證。中醫認為“六腑以通為用”，六腑傳化水谷，需不斷收納、消化、傳導和排泄，虛實更替，宜通而不宜滯，因此通腑法在腑氣不通及胃腸功能受損方面屢有見效。大黃作為通腑要藥在《神農本草經》中早有記載：“蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調中化食，安和五臟”。藥理研究表明本院內制劑具有抗凝和抑制血小板黏附、聚集、釋放及擴張血管的作用，保護腸黏膜屏障功能，減少細菌移位，改善腸黏膜微循環的作用[6]。李軍等[7]實驗證實急腹癥Ⅲ號治療急性胰腺炎后小腸組織學損害減輕，細菌腸外器官移居程度下降，此結果與陳德昌等[8]的研究結果相符。其治療重癥胰腺炎和降低死亡率機制部分是通過保護腸黏膜屏障功能和減輕小腸缺血性損傷來實現的。

腸黏膜屏障及免疫系統受損，隨之發生細菌和內毒素易位，可導致全身炎癥反應（SIRS）和多器官功能衰竭（MODS）的發生[9，10]。腸黏膜通透性增高是腸屏障功能受損的重要表現[11]，腸道黏膜通透性增高常常出現在腸黏膜形態學之前。因此，通過測定尿L/M比值可有效地反映腸道通透性的改變[12]。谷氨酰胺對危重患者的腸道保護作用已初步得到肯定[13]，它可以減輕腸屏障損害，防止腸源性感染[14，15]，抑制小腸黏膜萎縮[16]，本實驗通過院內制劑急腹癥Ⅲ號與谷氨酰胺及空白對照組對比研究發現呼吸機相關性肺炎模型腸道通透性增高（安慰劑組L/M高于空白對照組（P<0.05），細菌移位率增加（安慰劑組明顯高于空白對照組（P<0.01）。此結果與Diebel LN等[17]研究結果相似。

綜上，院內制劑急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺均能減輕呼吸機相關性肺炎腸黏膜結構的破壞，降低腸道通透性及減少腸道菌群移位。關于大黃制劑的作用機制，主要有促進腸道蠕動、改善胃腸黏膜血流[18]、維護腸黏膜黏液屏障、阻止腸道菌群移位、防止腸道內毒素入侵[19]、保持腸道菌群平衡，具有抗炎作用[20]，急腹癥Ⅲ號為復方制劑，具體作用成分及機制有待進一步研究探討。

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（收稿日期：2017-09-18）endprint