P27通過調控Bcl—2對哮喘大鼠氣道平滑肌重塑的影響

徐慧　　雷丹　　彭燕平　　戴元榮

[摘要] 目的 觀察P27kip-1（以下簡稱P27）是否通過調控Bcl-2影響哮喘大鼠氣道重塑的發生發展。 方法 SPF級雄性大鼠30只隨機分成正常對照組和哮喘組，各15只。用卵白蛋白（OVA）致敏和激發的方法制備哮喘模型。觀察各組大鼠肺組織病理超微結構變化，分析支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的細胞分類計數，并采用免疫組化法測定各組大鼠肺組織中P27、Bcl-2表達情況。 結果 哮喘組嗜酸粒細胞計數比例均顯著高于對照組（P<0.01），哮喘組肺組織P27表達低于對照組（P<0.01），哮喘組肺組織Bcl-2表達高于對照組（P<0.01）。 結論 P27通過調控Bcl-2抑制氣道平滑肌細胞增生進而影響氣道重塑。

[關鍵詞] 哮喘；P27；Bcl-2；氣道重塑

[中圖分類號] R562.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）34-0028-04

Effect of P27 on airway smooth muscle remodeling in asthmatic rats by regulating Bcl-2

XU Hui LEI Dan PENG Yanping DAI Yuanrong

Department of Respiratory Diseases， Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325027， China

[Abstract] Objective To investigate whether P27kip-1（hereinafter referred to as P27） regulates the development of airway remodeling in asthmatic rats via Bcl-2. Methods 30 SPF male rats were randomly divided into normal control group（n=15） and asthma group（n=15）. Asthma models were prepared by sensitization and challenge with ovalbumin （OVA）. The pathological and ultrastructural changes of lung tissue in each group were observed. The cell differential count in bronchoalveolar lavage fluid（BALF） was analyzed. The expressions of P27 and Bcl-2 in lung tissue of each group were detected by immunohistochemistry. Results The percentage of eosinophil count in asthma group was significantly higher than that in control group（P<0.01）. The expression of P27 in lung tissue of asthma group was lower than that in control group（P<0.01）. The expression of Bcl-2 in lung tissue of asthma group was higher than that in control group（P<0.01）. Conclusion P27 inhibits airway smooth muscle cell proliferation and thus affects airway remodeling through the regulation of Bcl-2.

[Key words] Asthma； P27； Bcl-2； Airway remodeling

支氣管哮喘（哮喘）發病的病理基礎為氣道重塑，目前對于改善或延緩氣道重塑缺乏有效對策。近年來，研究發現氣道平滑肌細胞（ASMC）重塑和凋亡失衡導致了支氣管哮喘的發生發展[1，2]。凋亡是在基因控制下，細胞自主、有序的死亡過程[3]。P27kip-1（以下簡稱P27）為細胞周期負性調節因子，分子量約27 kD，主要定位于細胞核，通過抑制周期蛋白E-周期蛋白依賴激酶2（cyclinE-CDK2）和周期蛋白D-周期蛋白依賴激酶4（cyclinD-CDK4）等激酶復合物活性，使細胞周期停滯在G1期，從而抑制細胞的增殖[4]。最近研究發現P27除了發揮G1期細胞阻滯以外，還具有調節細胞凋亡的功能。凋亡的調控涉及許多基因，Bcl-2作為抑制凋亡最重要的調控基因，在哮喘的發病機制中占有重要的地位[5，6]。Bcl-2家族蛋白在線粒體凋亡路徑中具有重要的調節作用，其中促凋亡蛋白，如Bax、Bid等可通過增強線粒體膜通透性，導致細胞色素C及其他促凋亡蛋白釋放[7]。本研究發現P27通過調節Bcl-2調控氣道平滑肌細胞的凋亡，現報道如下。

1材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級SD雄性大鼠30只，體質量160～200 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證SYXK（浙）2010～0150。兔抗鼠P27kip-1多克隆抗體（Cell Signal Technology，U.S.A），兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體（Cell Signal Technology，U.S.A），辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（Cell Signal Technology，U.S.A），TUNEL檢測試劑盒（北京中杉生物技術有限責任公司），SABC免疫組化二抗試劑盒（上海晶美生物技術有限公司），DAB顯色試劑盒（上海晶美生物技術有限公司）。endprint

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制備 按照隨機數字表法將30只SD大鼠隨機分為正常對照組（C組，n=15）和哮喘組（A組，n=15），飼養于溫州醫科大學實驗動物中心，參考相關文獻[8]略加改進制備哮喘模型，哮喘組分別于第1天和第8天大鼠腹腔注射1 mL OVA/AL（OH）3混合液，內含1 mg OVA和100 mg Al（OH）3致敏，正常對照組用生理鹽水代替。第15天開始用含1% OVA的生理鹽水進行激發，每日激發哮喘1次，共6周。哮喘組大鼠表現出呼吸急促、喘息、抽搐等癥狀，可聞及喘鳴音，嚴重者出現動作遲緩、俯臥不動、反應遲鈍等癥狀，對照組則無此癥狀，大體行為上提示造模成功，造模成功后繼續行組織切片觀察大鼠肺組織超微結構變化。

1.2.2 各組大鼠肺組織病理超微結構的變化 各組大鼠分別于末次激發后24 h內，10%水合氯醛溶液（5 mL/kg）腹腔麻醉。切取左肺肺門中上、中下肺段組織，做石蠟包埋切片，分別做HE和免疫組化。切片在HE染色后，于光鏡下觀察哮喘組和正常對照組的肺組織結構，是否存在上皮損傷，以及觀察支氣管及血管周圍是否存在炎癥浸潤。

1.2.3 細胞分類計數 BALF液離心，取沉渣用PBS重懸后滴于載玻片上涂片，晾干后用加瑞氏染液固定，再加等量緩沖液與染料混勻后進行染色，約5～10 min，再用自來水緩慢沖去染液。在高倍鏡下，選擇染色良好的區域，并且按一定順序，對200個白細胞做細胞分類計數。

1.2.4 凋亡指數的測定 高倍鏡下（×400）隨機取管腔直徑1000 μm左右的支氣管，每張切片至少觀察500個支氣管平滑肌細胞，計算每100個支氣管平滑肌細胞中的凋亡細胞數，求得凋亡指數（AI），AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5 免疫組化法檢測 ASMCs上caveolin-1、p-AKT的表達 按SABC免疫組織化學染色方法檢測肺組織P27、Bcl-2蛋白表達。試劑盒為上海晶美生物技術有限公司生產，按說明書操作步驟進行操作，P27、Bcl-2抗體的稀釋度均為1∶100。對照試驗選用PBS代替一抗，其他步驟相同。以氣道平滑肌層為分析對象，進行測定P27、Bcl-2陽性表達的平均吸光度值。

1.3 統計學方法

應用 SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析，計量資料予以正態性檢驗，用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，兩變量的相關分析采用Pearson等級相關法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠癥狀、體征比較

在連續OVA激發后，哮喘組大鼠出現打噴嚏、煩躁不安、呼吸急促、口腔分泌物增多等癥狀，并且有哮鳴音，部分情況嚴重的出現腹肌抽搐、反應遲鈍、行動遲緩等表現，但無大鼠死亡，對照組則無此種表現。

2.2 兩組大鼠肺組織病理結構的變化

兩組大鼠的肺組織石蠟切片，進行HE染色后，在光鏡下觀察到A組大鼠肺組織內支氣管上皮斷裂、脫落，支氣管壁和血管周圍可見較多的炎性細胞如嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤，管腔內可見黏液栓形成，對照組未見上述現象。見封三圖2。TUNEL法顯示：哮喘組大鼠ASMC中TUNEL陽性細胞明顯少于正常對照組，凋亡指數（AI）哮喘組為（3.6±0.2），正常對照組為（6.1±0.3），（t=11.12，P<0.01），見封三圖3。

2.3兩組大鼠中細胞分類計數的比較

哮喘組大鼠BALF中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞占細胞總數的百分比均顯著高于正常對照組（P<0.01），綜合上述結果提示哮喘造模成功，見表1。

2.4 免疫組化結果

免疫組化觀察各組大鼠肺組織P27、Bcl-2表達。Bcl-2蛋白均表達于胞漿，陽性細胞胞漿呈棕黃色，主要定位于平滑肌細胞、支氣管上皮細胞及散在的炎性細胞，哮喘組Bcl-2表達量明顯高于正常對照組（P<0.01），見封三圖4。P27蛋白主要定位在細胞核，胞質少量表達，哮喘組P27表達量明顯低于正常對照組（P<0.05），見封三圖5，表2。

2.5相關性分析

平滑肌細胞中P27表達與細胞凋亡呈正相關（r=0.612，P<0.05）。

3 討論

近年來隨著對支氣管哮喘發病機制研究的不斷深入，研究者發現氣道壁的結構改變即氣道重塑（airway remodeling）[9-12]是哮喘除氣道慢性炎癥以外又一重要病理特征，是哮喘患者出現不可逆或部分不可逆氣流受限及持續的氣道高反應性的病理學基礎。哮喘時氣道平滑肌細胞存在增殖增加和凋亡不足[13]，共同參與氣道重塑的形成。因此，應該把支氣管平滑肌細胞作為哮喘氣道重塑研究的標靶。

近年來，隨著細胞分子生物學的發展，對調控細胞增殖的中心事件即細胞周期的調控機制有了更為深刻的認識。各種絲裂原通過不同的信號傳導途徑促進細胞增殖，都是要經過細胞分裂周期來完成的，而各級細胞因子對細胞周期進行了精密的調控。P27基因定位于人類染色體12p13，編碼198個氨基酸，具有高保守性。P27蛋白主要定位于細胞核，N段第28-87位氨基酸中有兩個絲氨酸磷酸化位點，介導周期蛋白依賴激酶（CDK）活性的抑制。P27作為細胞周期負性調節因子，動物研究發現，幾乎所有組織均表達P27蛋白，參與細胞增殖和凋亡調節的P27蛋白極有可能在一些與細胞凋亡緊密相關的疾病中扮演著重要角色。對乳腺癌細胞和其他腫瘤細胞的研究表明P27的過度表達不僅誘導細胞周期阻滯，還促進凋亡發生[14-17]。凋亡通常發生在G1期，G1期的阻滯會加速或促進凋亡。所以G1晚期表達的P27蛋白應該是凋亡調節的節點之一。攜有P27的腺病毒載體已經在動物實驗中具有很好的促細胞凋亡作用。其對氣道平滑肌細胞的凋亡是否也有調節作用？P27是通過什么途徑促進細胞凋亡的？endprint

細胞凋亡是受嚴格控制的細胞死亡過程，與多種疾病密切相關，是當今生命科學研究中最熱門的領域之一。在細胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員起著至關重要的作用，其中Bcl-2被認為是抑制細胞凋亡最重要的調控基因。Bcl-2 家族對于線粒體膜上的膜通透性孔道的開放和關閉起關鍵的調節作用。有研究發現，Bcl-2可抑制線粒體膜電位的降低，減少細胞色素C和凋亡誘導因子的釋放及Caspase（半胱天冬酶）的激活，從而抑制細胞凋亡[18-19]。在無死亡信號刺激時，Bcl-2作為抗凋亡蛋白被細胞器膜隔離起來，在收到死亡信號刺激時便發生構象變化，從胞液易位到線粒體外膜上，使抗凋亡蛋白喪失對凋亡的抑制[20-21]。通過本實驗結果顯示哮喘組P27蛋白的表達量低于對照組，相關分析結果表明，P27表達量與細胞凋亡率呈正相關，提示P27分子可能參與調節氣道平滑肌凋亡過程，哮喘組P27表達減少，Bcl-2表達增加，導致平滑肌細胞凋亡不足，促進了哮喘氣道重塑。本課題組前期研究發現，P27能激活線粒體凋亡通路，促進細胞凋亡，本研究結果顯示，其作用機制可能是通過調控Bcl-2實現的。

[參考文獻]

[1] Xu W，Guo GF，Li JJ，et al.Activation of Bcl-2-caspase-9 apoptosis pathway in the testis of asthmatic mice[J]. PLos One，2016，11（3）：e0149353.

[2] Jung KH，Won PD，Ji-Young S，et al. The Wnt/β-catenin signaling pathway regulates the development of airway remodeling in patients with asthma[J]. Exp Mol Med，2015， 47（12）：e198.

[3] Peng YT，Chen P，Ouyang RY，et al. Multifaceted role of prohibitin in cell survival and apoptosis[J]. Apoptosis，2015， 20（9）：1135-1149.

[4] Hitoshi Hino，Ping Dai，Tatsushi Yoshida，et al. Interaction of Cx43 with Hsc70 regulates G1/S transition through CDK inhibitor p27[J]. Sci Rep，2015，5：15365.

[5] Wang HX，Zhang ZF，Wei XP，et al. Small-molecule inhibitor of Bcl-2（TW-37） suppresses growth and enhances cisplatin-induced apoptosis in ovarian cancer cells[J]. J Ovarian Res，2015，8：3.

[6] Wen XX，Zhou J，Zhang D，et al. Denatonium inhibits growth and induces apoptosis of airway epithelial cells through mitochondrial signaling pathways[J]. Respir Res，2015，16（1）：13.

[7] Foight GW，Keating AE. Locating herpesvirus Bcl-2 homologs in the specificity landscape of anti-apoptotic Bcl-2 proteins[J]. J Mol Biol，2015，427（15）：2468-2490.

[8] Palmas E，Kips JC，Pauwels RA. Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicin，2000，161（2）：627-635.

[9] Heinz Fehrenbach，Christina Wagner，Michael Wegmann. Airway remodeling in asthma：What really matters[J]. Cell Tissue Res，2017，367（3）：551-569.

[10] Hai-Yan Lin，Lei Xu，Shuan-Shuan Xie，et al. Mesenchymal stem cells suppress lung inflammation and airway remodeling in chronic asthma rat model via PI3K/Akt signaling pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（8）：8958-8967.

[11] Hu M，Ou-Yang HF，Han XP，et al. KyoT2 downregulates airway remodeling in asthma[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（11）：14171-14179.

[12] Davies ER，Kelly JFC，Howarth PH，et al. Soluble ADAM33 initiates airway remodeling to promote susceptibility for allergic asthma in early life[J]. JCI Insight，2016，1（11）：e87632.endprint

[13] Dan Yu，George Makkar，Tuo Dong，et al. MARCKS signaling differentially regulates vascular smooth muscle and endothelial cell proliferation through a KIS-，p27 kip1-dependent mechanism[J]. PLoS One，2015，10（11）：e0141397.

[14] Serena Fernandez，Maurizio Risolino，Nadia Mandia，et al.miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer[J]. Oncogene，2015，34（25）：3240-3250.

[15] Podmirseg SR，J？覿kel H，Ranches GD，et al. Caspases uncouple p27kip-1 from cell cycle regulated degradation and abolish its ability to stimulate cell migration and invasion[J]. Oncogene，2016，35（35）：4580-4590.

[16] Yalcin A，Clem BF，Imbert-Fernandez Y，et al.6-Phosphofructo-2-kinase （PFKFB3） promotes cell cycle progression and suppresses apoptosis via Cdk1-mediated phosphorylation of p27[J]. Cell Death Dis，2014，5（7）：e1337.

[17] Priyank Patel，Benedikt Asbach，Elina Shteyn，et al. Brk/Protein tyrosine kinase 6 phosphorylates p27KIP1，Regulating the activity of cyclin D-cyclin-dependent kinase 4[J]. Mol Cell Biol，2015，35（9）：1506-1522.

[18] Aurelie Moya，Kazuhiro Sakamaki，Benjamin M Mason，et al. Functional conservation of the apoptotic machinery from coral to man：The diverse and complex Bcl-2 and caspase repertoires of acropora millepora[J]. BMC Genomics，2016，17：62.

[19] Katelyn L O'Neill，Kai Huang，Jingjing Zhang，et al. Inactivation of prosurvival Bcl-2 proteins activates Bax/Bak through the outer mitochondrial membrane[J]. Genes Dev，2016，30（8）：973-988.

[20] AR Delbridge，Strasser A. The BCL-2 protein family，BH3-mimetics and cancer therapy[J]. Cell Death Differ，2015，22（7）：1071-1080.

[21] Aaron N Hata，Jeffrey A Engelman，Anthony C Faber. The BCL-2 family：Key mediators of the apoptotic response to targeted anti-cancer therapeutics[J]. Cancer Discov，2015，5（5）：475-487.

（收稿日期：2017-10-25）endprint