隱丹參酮誘導乳腺癌 MDA—MB—231 細胞凋亡的研究

周南陽+趙虹

[摘要] 目的 探討隱丹參酮對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響及其機制。 方法 用不同濃度的隱丹參酮處理MDA-MB-231細胞24 h。采用 MTT、流式細胞術檢測不同濃度隱丹參酮對MDA-MB-231細胞活性、凋亡的影響。采用Western blot檢測MDA-MB-231細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平。 結果 與0 μmol/L對照組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L隱丹參酮組MDA-MB-231細胞存活率顯著降低，且呈劑量依賴（P<0.05）。流式細胞儀檢測顯示隱丹參酮在20 μmol/L濃度時MDA-MB-231細胞凋亡率為（6.34±0.52）%，與對照組（6.09±0.76）%相比無統計學差異（P>0.05）。在40 μmol/L、80 μmol/L濃度時MDA-MB-231細胞凋亡率分別是（18.74±0.65）%、（28.04±3.08）%，與對照組相比有統計學差異（P<0.05），且兩濃度組之間相比差異亦有統計學意義（P<0.05）。Western blot結果顯示，與對照組相比，隱丹參酮在40 μmol/L、80 μmol/L濃度時，MDA-MB-231細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調（P<0.05），同時，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達顯著增加（P<0.05）。 結論 隱丹參酮可誘導三陰乳腺癌MDA-MB-231 細胞凋亡，其機制可能與激活Bax、Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡調控基因有關。

[關鍵詞] 隱丹參酮；乳腺癌；MDA-MB-231細胞；凋亡

[中圖分類號] R273 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）34-0038-05

Study of cryptotanshinone inducing apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells

ZHOU Nanyang1 ZHAO Hong2

1.Department of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital， Hangzhou 310008， China； 2.Department of Breast Surgery， the First Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310006， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of cryptotanshinone on the apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism. Methods MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of cryptotanshinone for 24h. The effects of different concentrations of cryptotanshinone on the activity and apoptosis of MDA-MB-231 cells were detected by MTT and flow cytometry. Western blot was used to detect the protein expressions of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in MDA-MB-231 cells. Results Compared with that of the 0 μmol/L control group， the survival rates of MDA-MB-231 cells in 10， 20， 40， 80 μmol/L cryptotanshinone groups were significantly decreased（P<0.05）. And the survival rate was dose-dependent.Flow cytometry showed that the apoptosis rate of MDA-MB-231 cells was（6.34±0.52）% at cryptotanshinone concentration of 20 μmol/L， which was not significantly different from that of the control group （6.09±0.76）% （P>0.05）. The apoptosis rates of MDA-MB-231 cells were （18.74±0.65）% and （28.04±3.08）% respectively at 40 μmol/L and 80 μmol/L， which were different from those of the control group（P<0.05）， and the difference between the two concentration groups was statistically significant（P<0.05）. Western blot results showed that anti-apoptotic protein Bcl-2 expression in MDA-MB-231 cells was significantly down-regulated at cryptotanshinone concentrations of 40 μmol/L and 80 μmol/L， compared with that of the control group（P<0.05）. Meanwhile， the expression of pro-apoptotic proteins Bax and Caspase-3 increased significantly（P<0.05）. Conclusion Cryptotanshinone can induce the apoptosis of triple negative MDA-MB-231 cells， which may be related to the activation of apoptosis regulatory genes including Bax，Caspase-3 and Bcl-2.endprint

[Key words] Cryptotanshinone； Breast cancer； MDA-MB-231 cells； Apoptosis

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年增加，目前居女性癌死亡率第一位[1]。其中，以雌激素、孕激素及人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）表達陰性的三陰乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）惡性程度最高，因其對內分泌治療和抗Her-2靶向治療不敏感，故生存率比非三陰性乳腺癌差[2，3]。針對抗三陰乳腺癌的新藥研究成為目前乳腺癌治療的重點之一。隱丹參酮（Cryptotanshinone）是從中藥丹參根中提取分離的二萜醌類有效單體，具有抗炎、抗菌、抗動脈粥樣硬化等多種生物學活性和藥理效應[4，5]。近年來文獻報道，隱丹參酮可有效抑制多種腫瘤細胞增殖、侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制血管生成，從而發揮其抗腫瘤的作用[6，7]。目前，有關隱丹參酮對乳腺癌細胞凋亡的影響及其機制尚不清楚。本研究以三陰乳腺癌 MDA-MB-231細胞為研究對象，用不同濃度隱丹參酮干預，檢測其對細胞活性和凋亡的影響，檢測抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達水平，從而觀察隱丹參酮對MDA-MB-231細胞凋亡的影響，并初步探究其機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

乳腺癌MDA-MB-231細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，本實驗室傳代保存。胎牛血清和 RPMI 1640 培養基購自Hyclone 公司。隱丹參酮購自成都曼思特生物科技有限公司（純度大于98%）（圖1），將隱丹參酮溶于 DMSO配制成等20 mmol/L的儲備液，分裝后于-20℃儲存；使用時用無血清 RPMI 1640 培養液稀釋為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的工作液，DMSO 終濃度為 0.1%，對照組為含0.1% DMSO的細胞培養液。兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG購自 Cell Signaling Technology公司。Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自美國Bio-Rad公司。流式抗體 Annexin V-FICT/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 乳腺癌 MDA-MB-231 細胞在37℃，5% CO2條件下，常規培養于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養基。當細胞密度達 90%并處于對數生長期時，用 0.25%胰酶消化傳代培養。

1.2.2 細胞活性檢測 取對數生長期的MDA-MB-231細胞，接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，細胞數1×104/孔，每組設5個復孔。培養 24 h后，吸棄原培養液，各孔分別加入 200 μL 含有不同濃度隱丹參酮的工作液（0、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L），同時設調零孔。繼續培養24 h后，利用 MTT 法在波長490 nm 處檢測各組樣品吸光度值（A490）。細胞存活率=（實驗組A值-對照組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%，對照組定義為100%。實驗重復3次。

1.2.3 細胞凋亡檢測 取對數生長期的MDA-MB-231細胞，接種于6孔板，3×105/孔，每組設3個復孔。培養24 h后，吸棄原培養液，以不同濃度隱丹參酮（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）處理細胞。繼續培養24 h后，收集1×105細胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，加入 5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide 混勻后，溫室避光孵育染色10 min。用流式細胞儀進行檢測。實驗重復 3 次。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達 取對數生長期MDA-MB-231細胞，接種于6孔板，1×106/孔，待細胞融合至 80% 時，以不同濃度隱丹參酮（0、40 μmol/L、80 μmol/L）處理細胞。繼續培養24 h，收集細胞，4℃預冷的PBS洗滌3次，加入75 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白，bradford法測蛋白質濃度。取 25 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白后轉移至 PVDF 膜，用5% BSA/TBST封閉液室溫下封閉1 h，洗膜后加入抗Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin 一抗（1∶1 000稀釋 ），4°C孵育過夜，TBST洗膜 3 次，加入二抗（1∶1 000稀釋）室溫下孵育2 h，TBST 洗膜 3 次，將化學發光增強液A和B等體積混勻涂抹于PVDF膜上，用Bio-Rad凝膠成像系統獲取圖像。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用 SPSS 17.0 統計學軟件分析，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隱丹參酮對MDA-MB-231細胞活性的影響

本研究用MTT法檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細胞活性的影響，結果顯示，在隱丹參酮作用24 h后，與對照組（0 μmol/L）相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L組MDA-MB-231細胞存活率分別為（77.07±0.83）%、（62.49±1.00）%、（49.41±0.48）%、（38.98±5.06）%。與對照組相比，各濃度組差異具有統計學意義（P<0.05），兩兩比較結果顯示，各濃度之間差異有統計學意義（P<0.05），表明隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細胞活性，且呈劑量依賴（圖2）。endprint

2.2 隱丹參酮對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

本研究用Annexin V-FICT/PI雙染流式細胞術檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細胞凋亡的影響，結果顯示，隱丹參酮在20 μmol/L濃度時對MDA-MB-231細胞凋亡率為（6.34±0.52）%，與對照組（6.09±0.76）%相比無統計學差異；隱丹參酮在40 μmol/L、80 μmol/L濃度時對MDA-MB-231細胞凋亡率分別是（18.74± 0.65）%，（28.04±3.08）%。與對照組（6.09±0.76）%相比差異具有統計學意義（P<0.05），兩濃度組之間差異有統計學意義（P<0.05），表明隱丹參酮濃度大于40 μmol/L時可誘導MDA-MB-231細胞遷移，且呈劑量依賴（圖3）。

2.3 隱丹參酮對抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達的影響

本研究用Western blot檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細胞抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達的影響。結果顯示，在隱丹參酮作用24 h后，與對照組（0 μmol/L）相比，40 μmol/L、80 μmol/L組MDA-MB-231細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調，同時，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達顯著增加（P<0.05），且兩濃度之間差異有統計學意義（P<0.05）（圖 4）。

3 討論

三陰性乳腺癌在臨床治療中常伴隨易耐藥、易復發、轉移率高等特點，是目前乳腺癌治療中的難題之一[8]。隱丹參酮是從中藥丹參根中提取分離的二萜醌類有效單體，具有抗炎、抗菌、抗動脈粥樣硬化等多種藥理效應[4，5]。隨著研究的深入，其抗腫瘤的特性也得到證實[6，7]。近年研究發現，隱丹參酮可通過下調STAT3通路抑制腎細胞癌增殖，誘導細胞凋亡[9]。Kim EJ等[10]通過體內外實驗研究發現，隱丹參酮作為一種新的拓撲異構酶Ⅱα抑制劑，對前列腺癌PC-3細胞的生長具有顯著的抑制作用，且對正常組織沒有明顯的細胞毒性。另有動物實驗結果表明，在人肺癌裸鼠原位移植模型中，隱丹參酮能有效抑制腫瘤形成，誘導其凋亡，同時可改善機體狀況[11]。因此，隱丹參酮抗腫瘤活性具有一定的研究前景。本研究前期研究結果顯示，隱丹參酮在體外可顯著抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞中c-Src和FAK 蛋白的磷酸化，下調MMP2蛋白，從而抑制其遷移和侵襲。本研究結果表明，隱丹參酮可誘導乳腺癌 MDA-MB-231細胞凋亡，且呈劑量依賴性。Western blot結果表明隱丹參酮顯著抑制 MDA-MB-231細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達，增加促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達，初步揭示了隱丹參酮誘導乳腺癌 MDA-MB-231細胞凋亡的分子機制。

細胞凋亡是細胞受環境刺激后，在基因編程調控下產生的細胞自主性死亡過程[12]。腫瘤細胞可通過激活或抑制凋亡相關信號通路，從而維持其不斷增殖并避免發生凋亡[12]。其中，Caspase 蛋白酶級聯反應、Bcl-2 家族抗凋亡和促凋亡蛋白表達的改變與凋亡的發生密切相關[13]。Caspase-3，被稱為“死亡執行蛋白酶”是Caspase 家族中最重要的凋亡執行者之一，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分[13]。活化的 Caspase-3可直接剪切DNA 依賴性蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶，從而影響細胞DNA的復制、轉錄及修復過程，最終導致細胞的凋亡[14]。臨床研究發現，維生素C和甲氨蝶呤聯合治療可激活Caspase-3抑制三陰性乳腺癌細胞的生長[15]。本研究發現濃度大于40 μmol/L隱丹參酮可顯著增加MDA-MB-231細胞Caspase-3表達水平，且隨濃度增加作用增強，提示隱丹參酮可能通過激活Caspase-3誘導MDA-MB-231 細胞凋亡。

Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡信號通路中關鍵的凋亡調節因子[16]。其中，Bcl-2是抑制凋亡作用發揮的主要蛋白，為線粒體膜的整合蛋白，其基因定位于18號染色體21區[17]。Bcl-2可通過抑制線粒體內細胞色素C和凋亡誘導因子AIF等促凋亡蛋白的釋放阻止凋亡的進程[17]。Bax是促凋亡的代表成員之一，其位于19q13.3～q13.4區[18]。Bax在接收到凋亡信號刺激被激活，移位并插入線粒體外膜后形成Bax大孔道，破壞線粒體膜的完整性發揮促凋亡作用[18]。此外，Bcl-2和Bax可通過同源和異源性二聚體來調節細胞凋亡[19]。在正常情況下，Bcl-2和Bax在細胞中表達量相對穩定，而當Bcl-2在細胞內高表達時，Bax/Bax同源二聚體的大量解離，促使細胞出現抗凋亡作用，從而引起腫瘤的發生[19]。研究發現，人參皂苷可通過上調Bax/Bcl-2比值協同紫杉醇誘導三陰性乳腺癌細胞凋亡[20]。本研究發現濃度大于40 μmol/L 隱丹參酮可抑制 MDA-MB-231 細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達，增加促凋亡蛋白Bax，上調Bax/Bcl-2比值，提示隱丹參酮促凋亡機制可能是通過下調Bcl-2、上調Bax，破壞線粒體膜完整性而促發。

綜上所述，隱丹參酮可誘導三陰乳腺癌MDA-MB-231 細胞凋亡，其機制可能與激活Bax、Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡調控基因有關。本研究為隱丹參酮應用于乳腺癌的治療積累了前期實驗基礎。但是，有關隱丹參酮對乳腺癌細胞其他凋亡調節蛋白表達的影響，其與化療藥物及靶向藥物等治療手段的配伍協同效應，以及在動物模型上抗癌效應及機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2017-09-29）endprint