非抗生素飼料添加劑在家禽彎曲桿菌控制中的應用

席　麗，秦新喜，李志強，韓進誠，張　遼，張春梅

（商丘師范學院生物與食品學院，河南商丘 476000）

彎曲桿菌病是目前世界上最常見的食源性人畜共患病之一。據報道，每年約有5億例彎曲桿菌感染病例的發生（Kashoma，2015）。彎曲桿菌屬目前有32個種13個亞種，其中最主要的是空腸彎曲桿菌（占感染的95%）和結腸彎曲桿菌（占感染的5%）（Hansson，2018）。彎曲桿菌普遍存在于家禽胴體、腸道及糞便中。消費者、活禽交易者和屠宰加工人員等可通過接觸活禽、加工制品、食用未完全煮熟的禽肉或飲用被污染的水而感染彎曲桿菌。該菌進入動物胃腸道內可黏附于腸道黏膜上皮細胞上，引起毒素介導的炎癥反應（Shank，2018）。長期處于抗生素壓力環境中的彎曲桿菌產生了多重耐藥性，表現為對環丙沙星、萘啶酮酸、四環素、紅霉素、阿奇霉素、鏈霉素、慶大霉素、氯霉素及氨芐西林等兩種或兩種以上抗生素具備抵抗力（Cantero，2018；Gutiérrez，2017）。彎曲桿菌耐藥性的產生和擴大不僅降低抗生素對家禽彎曲桿菌的有效控制率，還可能影響人類彎曲桿菌病的治療效果，此外，抗生素的殘留問題亦不容忽視。因此，家禽業正在尋求新的抗生素替代策略去降低活禽體內彎曲桿菌的攜帶率。本文對益生元、益生菌、噬菌體、有機酸及植物源性提取物等作為飼料添加劑對家禽控制彎曲桿菌的作用、機制及對家禽生產性能的影響做以闡述，以期為家禽生產中彎曲桿菌的控制提供理論基礎。

1　益生菌

益生菌是一類活的微生物，通過多種途徑可改善宿主的健康狀況，包括：（1）保持胃腸道內常在菌與病原菌的平衡；（2）提高營養物質的消化率和吸收率；（3）發揮免疫調節和免疫刺激作用。Smialek等（2018）在探索益生菌混合物（乳酸乳球菌 1×109cfu/g、廣布肉毒桿菌1×109cfu/g、干酪乳桿菌1×109cfu/g、植物乳桿菌1×109cfu/g和釀酒酵母1×107cfu/g）在抵抗肉雞彎曲桿菌感染中的可行性時，將上述混合物以0.5 kg/t飼料的劑量添加于Ross 308肉雞日糧中，研究結果表明，肉雞飼料中添加該益生菌混合物可降低彎曲桿菌對肉雞胃腸道的侵襲力，從而減少家禽飼養環境中的污染，最終改善肉雞屠宰過程中的相關衛生指標。此外，該益生菌混合物還顯示出良好的免疫調節作用，可提高肉雞群整體防疫計劃的有效性。Nothaft等（2017）研究表明，羅伊乳桿菌與大腸埃希菌（Escherichia coli，E. Coli）表達彎曲桿菌N-葡聚糖基因工程苗共用，可顯著增強該疫苗的免疫效果。Saint Cyr等（2017）將唾液乳桿菌SMXD51添加于1日齡肉雞日糧中，分別于14日齡和35日齡時測定盲腸彎曲桿菌的攜帶量，結果表明，該益生菌可顯著減少14日齡和35日齡肉雞盲腸內彎曲桿菌的攜帶量（14日齡 ：0.82 lg cfu/g；35日齡 ：2.81 lg cfu/g），同時可以使73%添加組的肉雞彎曲桿菌攜帶量控制在7 lg cfu/g 以下。分類學分析顯示，唾液乳桿菌SMXD51可誘導肉雞腸道微生物菌系發生顯著變化，還可部分限制彎曲桿菌對Anaerotruncus屬細菌的抑制作用及Subdoligranulum屬細菌的促進作用。肉雞體內試驗結果表明，該菌株具有一定的抗彎曲桿菌及改善胃腸道微生物菌系的能力。定期補充益生菌不僅可以降低家禽感染和患病風險，還可以降低家禽制品中病原菌如彎曲桿菌、沙門氏菌、李斯特菌等的污染，從而提高家禽類食品的安全性。

2　噬菌體

噬菌體是一類細菌病毒，可特異性感染并裂解靶細菌。近年來噬菌體作為一種新型生物控制措施應用于動物生產和食品加工過程中控制食源性病原菌的研究逐漸增多（Wernicki，2017）。根據噬菌體的形態、基因組大小和限制性核酸內切酶圖譜可將彎曲桿菌裂解型噬菌體分為3類，即Group I～ Group III（Javed，2014）。其中 Group II成員對空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌均具有感染性，相比較之下，從家禽分離到的Group III成員對某些空腸彎曲桿菌菌株具有更強的裂解活性（Loc Carrillo，2005）。鑒于彎曲桿菌對噬菌體也可產生抗性這一現象，研究者試圖通過使用2種及以上同組或不同組噬菌體來解決該問題。Hammerl等（2014）在比較多種Group II和Group III成員的宿主范圍和裂解活性的基礎上，比較兩組噬菌體混懸物（CP14和CP81，各5.0×108PFU Vs. CP14和 CP68，5.0×108PFU和5.0×1010PFU）用于人工感染彎曲桿菌3871菌株的雄性Vrolix肉仔雞的治療效果。盲腸內彎曲桿菌計數結果顯示，單獨使用CP14可降低彎曲桿菌至少1 lg單位，CP14和CP81混合處理組對盲腸內彎曲桿菌無影響，而CP14和CP68混合處理組可降低彎曲桿菌至少3 lg單位。該結果說明，在使用多種噬菌體混合物時，需要根據其特性來篩選。抗性試驗結果顯示，肉雞盲腸內分離到的彎曲桿菌對Group II成員CP68抗性最低（1%～ 2%），對來源于 Group III的 CP14和CP81產生的抗性可分別達到5%和4%。值得注意的是，彎曲桿菌對CP14和CP81混合處理組的抗性顯著增高（7%～8%），這可能是導致該處理組盲腸內彎曲桿菌數未受控制的原因。Furuta等（2017）從購買的商品禽肉樣品中分離到噬菌體，通過與當地家禽肝臟、肉、腸道及皮膚上分離到的彎曲桿菌共培養，獲得當地優勢彎曲桿菌特異性噬菌體混合物，應用于肉雞飼養中同樣可極顯著減少彎曲桿菌的數量。如上所述，應用多種噬菌體除了可以降低彎曲桿菌產生抗性的機率，還可能更好地抵抗生產中空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌的眾多菌株，從而起到更好的防治效果。在使用噬菌體混合物時，需要對混合物中所有噬菌體的抗性進行詳細研究，并最好選擇來源于不同組別的噬菌體，以拓寬其宿主范圍、裂解能力，同時降低細菌對噬菌體的抗性產生能力。

3　益生元

益生元是一類可發酵的食物成分，可以選擇性的刺激遠端腸道有益菌的增殖。研究表明，益生元可利用多種機制，如產生短鏈脂肪酸、調節pH、與病原菌競爭結合位點等來改善宿主的健康狀況。如雙歧桿菌和乳酸菌可發酵低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）和低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）產生短鏈脂肪酸抑制病原菌的定植和生長（Guyard，2016）。Park等（2017）比較抗生素BMD50與益生元Biolex?MB40（釀 酒 酵 母 細 胞 壁 中 提 取 的 1，3-1，6-β-D-葡聚糖和甘露寡糖混合物）在肉仔雞生長性能和盲腸微生物群的影響時發現，42日齡肉雞益生元添加組白肉產出量極顯著高于空白對照組和抗生素添加組，28日齡肉雞盲腸彎曲桿菌數量顯著低于空白對照組及抗生素添加組。另外，抗生素添加組極顯著降低14日齡肉雞腸道乳酸菌的數量。肉雞生長性能的保持和白肉產量的提高、腸道彎曲桿菌數量的減少表明益生元Biolex?MB40可能替代抗生素成為家禽促生長劑的一種。Baffoni等（2017）驗證一種微膠囊化的合生元制劑（長雙歧桿菌PCB133和低聚木糖）對肉仔雞空腸彎曲桿菌的控制效果，盲腸內微生物學分析結果顯示，長雙歧桿菌PCB133可以成功定植于盲腸內，同時盲腸內微生物群生理特性發生改變，空腸彎曲桿菌的數量顯著減少。上述結果顯示，該合生元制劑在養殖環節可有效降低肉雞空腸彎曲桿菌的攜帶量，從而提高禽肉制品的生物安全性。

4　有機酸

有機酸或中鏈脂肪酸（medium chain fatty acids，MCFA）因其抗菌活性成為常用飲用水或飼料添加劑。Guyard等（2017）比較多種飼料添加劑對肉雞彎曲桿菌攜帶量的影響發現，陽離子交換黏土型飼料添加劑與有機酸混合物（甲酸、甲酸鈉、乳酸、丙酸）共同添加于71～78日齡散養肉雞日糧及飲用水中，可顯著降低雞群彎曲桿菌攜帶量（與空白組相比，降低（0.82±0.25）lg cfu/g），而且還可顯著降低屠宰時頸部皮膚彎曲桿菌的攜帶量（與空白組相比，降低（0.68±0.25）lg cfu/g），從而減少彎曲桿菌的傳播及人類彎曲桿菌病的發病率。Gracia等（2016）將脂肪酸單甘油酯及中鏈脂肪酸混合飼喂1日齡Ross 308，與對照組相比，可顯著降低盲腸彎曲桿菌的數量并可保持該作用到42日齡，因此，推測該混合物可作為一種較為長效的抑制劑應用于肉雞彎曲桿菌的控制中。Thibodeau等（2015）研究肉仔雞盲腸內彎曲桿菌的定植及一種混合酸酚飼料添加劑（主要成分山梨酸和百里香酚）對盲腸菌群的影響，結果表明，空腸彎曲桿菌在盲腸內的定植對盲腸菌群β多樣性有影響；混合酸酚添加于日糧中可減少肉雞空腸彎曲桿菌0.7 lg cfu，同時對盲腸菌群α和β多樣性無影響，提示該添加劑可以在不干擾盲腸菌群的平衡下有效降低彎曲桿菌在盲腸內的定植。β-二羥基苯甲酸是一種植物酚類化合物，廣泛分布于被子植物中，用于保護植物免受病原微生物侵害。該物質已被證實可有效減少食源性病原菌，如沙門氏菌、單核增生性李斯特菌、大腸桿菌等。Wagle等（2017）將β-二羥基苯甲酸（β- resorcylic acid，BR，0.5%）飼喂 1日齡肉仔雞14 d，并于7日齡人工感染空腸彎曲桿菌4個菌株的混合物（106cfu/mL；250 mL/只），于第14天檢測盲腸內容物彎曲桿菌數量，結果顯示，BR添加組可顯著降低盲腸內彎曲桿菌數（2.5 lg cfu），同時不影響肉雞采食量和體增重。通過研究BR對彎曲桿菌定植能力（運動性、上皮細胞黏附性等）的影響發現，BR通過下調空腸彎曲桿菌編碼運動能力基因（motA，motB，fliA）和黏附能力基因（jlpA，ciaB）從而顯著降低彎曲桿菌的運動性和對Caco-2細胞的黏附及侵襲能力。這些結果表明，BR可以作為一種有潛力的飼料添加劑用于減少彎曲桿菌在肉雞腸道中的定植。

5　植物源性飼料添加劑

植物源性生物活性物質根據其來源、配方、化學特性及純度可分為以下4類：（1）草本（來自非木本、非多年生的開花植物）；（2）植物制劑（整個或部分植株，如，根、葉、樹皮等）；（3）精油（芳香植物的揮發性成分經蒸餾、壓榨、萃取等方法獲得的油狀物質）；（4）油樹脂（植物辛香料經非水溶性溶劑濃縮萃取物）。某些植物及其特定成分提取物被研究證實具有一定的抗菌活性，因此，眾多植物源性物質被開發用于改善動物生產性能及產品品質。與合成的抗生素和無機化合物相比，植物源性產品具有天然、毒性小、一般無殘留等優點，被認為是一種較為理想的家禽有機生產過程中使用的飼料添加劑。已有研究表明，植物源性飼料添加劑可改善肉雞生長性能，同時可降低病原菌的攜帶量。如辣椒素可減少盲腸內腸炎沙門氏菌、產氣莢膜梭菌和大腸桿菌的攜帶量；巨朱蕉提取的油樹脂可增加回腸和盲腸乳酸菌的數量，同時減少產氣莢膜梭菌的量；肉桂醛可增加腸道雙歧桿菌和乳酸菌的數量；麝香草酚可降低盲腸內容物中彎曲桿菌的數量（Diaz，2015）。月桂酸（十二烷酸），屬于中鏈脂肪酸，主要來源于椰子油、油粽籽油、巴巴蘇籽油及月桂油中。體外研究顯示，彎曲桿菌對月桂酸的抗菌活性敏感。Zeiger等（2017）利用體內研究方法檢測月桂酸添加在飼料中對Ross 308肉雞肌肉組織中脂肪酸構成及性狀和對結腸彎曲桿菌的影響。檢測結果顯示，肉雞胸淺肌乳酸含量極顯著升高；人工感染肉雞胸淺肌結腸彎曲桿菌（5.9 lg cfu/g），共孵育6 d（4℃）后，月桂酸添加組肉雞胸淺肌結腸彎曲桿菌攜帶量較對照組顯著減少（添加組：3.5 lg cfu/g Vs. 對照組 ：4.3 lg cfu/g），顯示肌肉中高水平月桂酸的抗菌活性。上述研究結果表明，月桂酸作為飼料添加劑應用于肉雞飼養中可通過降低雞肉中結腸彎曲桿菌的攜帶量從而提高食品安全。香芹酚通過作用于細菌細胞膜和細胞質的多個靶位點，可引起細菌細胞形態及功能的改變。Kelly等（2017）體外研究表明，香芹酚可減少彎曲桿菌對雛雞腸道上皮細胞的粘附和侵襲能力，并可抑制彎曲桿菌生物膜的形成。將香芹酚添加于肉雞日糧中，通過改善腸道菌群（乳酸菌、大腸桿菌等）的構成延遲肉雞彎曲桿菌的感染日齡（添加組35 d Vs. 空白對照組21 d），從而顯示出較好的抗生素替代物的潛能。

6　其他

彎曲桿菌的感染主要依賴于由極性鞭毛A介導的運動性、主要外膜蛋白的促生物膜生成能力及黏附作用（Mahdavi，2014）。因此，某些研究者正在嘗試通過抑制彎曲桿菌生物膜的形成來控制家禽彎曲桿菌的攜帶率。Khattak等（2018）研究鐵酪氨酸螯合物添加于日糧中對肉雞空腸彎曲桿菌的影響（試驗期：1～42日齡）發現，該添加劑可極顯著抑制空腸彎曲桿菌生物膜的形成，減少彎曲桿菌在盲腸內的定植，增加盲腸內揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）的含量。盲腸內VFA含量增加，指示盲腸內厭氧細菌的發酵功能增加，研究證實與肉雞腸道內腸桿菌科數量呈負相關。生物炭、膨潤土和沸石作為飼料添加劑具有良好的安全性和有益作用，同時其可選擇性地抑制病原菌的生長繁殖特性也受到人們的廣泛關注。Prasai等（2016）將上述3種飼料添加劑分別按4%的添加量添加于蛋雞日糧中，腸道菌群檢測結果顯示，生物炭、膨潤土和沸石添加劑對蛋雞腸道菌群的豐度和多樣性均無顯著影響，但某些種屬的細菌和某些潛在病原菌的數目有所減少。可操作分類單位（operational taxonomic units，OTUs）檢測結果顯示，膨潤土添加組蛋雞腸道內未檢測到已知彎曲桿菌屬成員，同時胃腸炎螺桿菌、鴨源雞桿菌、dorei擬桿菌和aldenense梭菌OTU未檢測到，提示上述病原微生物被膨潤土選擇性抑制。生物炭和沸石具有相似但較溫和的抑菌效果，其中生物炭可顯著減少變形菌門細菌的數量。

7　結論

綜上所述，上述非抗生素飼料添加劑可通過多種途徑，如抑制彎曲桿菌生物膜的形成、降低其粘附黏膜或上皮細胞的能力、提高機體免疫功能、改善腸道吸收功能及增加內源性物質的抑菌作用等減少家禽彎曲桿菌的攜帶率，從而降低空腸彎曲桿菌經生物或非生物途徑的傳播。此外，抑制生物膜生成還可能提高抗生素對抗彎曲桿菌感染的治療作用，最終降低人類彎曲桿菌病的發生率。但在商業推廣之前還需要對上述添加劑的生產標準、添加劑量、保護機制及經濟成本等問題做以詳細研究。除此之外，加強家禽生產中生物安全措施、飲水安全、抗生素正規治療、疫苗接種、遺傳育種能綜合措施的執行更有利于家禽彎曲桿菌的預防和控制。