三葉青遺傳資源與栽培技術研究進展

梁君瑛，韓素芳，應尚蛟，程詩明，徐 梁，張都海，張飛英，趙彩芳(1.浙江省航空護林管理站，浙江 杭州 10020； 2.永康市林業局，浙江 永康 0700； .浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 1002)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)隸屬于葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬(Tetrastigma),又名蛇附子、石抱子、石猴子、金線吊葫蘆等，是我國特有的民間藥用植物[1]。一般需要種植3～5年才能達到商品藥材的要求。以塊根或全草入藥，具有抗病毒、鎮痛與解熱、保肝等作用，毒副作用小，具有“植物抗生素”的美稱，臨床上已廣泛用于抗癌、抗腫瘤及抗艾滋病毒等[2]。不同產區、不同種質三葉青的地下塊根產量及有效成分含量存在明顯差異，且人工栽培難度較大，因此，資源評價、品種選育和栽培技術研究是三葉青生產及應用上亟待解決的重要課題。

1 遺傳資源

1.1 資源分布

三葉青對生長環境要求嚴格，常生長在陰濕的山坡、山溝、谷溪中，喜歡時隱時現的散光照射、濕潤的氣候。對土壤要求不嚴格，pH值5.0～7.0 的酸性至中性土壤均可生長。怕炎夏高溫，通常氣溫在25 ℃時生長良好，平均氣溫低于5～10 ℃時停止生長，忌強光暴曬，忌干旱。有極強的地域選擇性，水平分布為18°30′～32°20′N，垂直分布海拔為300～1 300 m，在我國福建、浙江、江西、廣西、廣東、海南、臺灣、云南、湖南等地均有發現，其中以廣西三葉青和浙江三葉青種類最多[3]。

1.2 資源形態

三葉青為多年生草質攀緣藤本，藤莖細軟，卷須與葉對生，卷須以直行捆綁式使藤攀爬于其他植物上，較老藤形扁、表皮紫褐色，較嫩藤形圓、表皮青色，葉互生，一柄長三葉，中葉稍大，葉呈卵狀披針形，邊緣有鋸齒，葉柄及葉片表面翠綠。每年5月開花，至秋季末結果，漿果球狀，黃豆般大小，成熟后色澤鮮紅艷麗，掛果期長達數月。塊根形狀主要有紡錘形、卵圓形、葫蘆形或橢圓形，單個或數個相連呈串珠狀[4]。

1.3 種質資源鑒定

朱波等[5]利用ISSR分子標記技術對從浙江、江西、福建、廣西、湖南、湖北等三葉青主分布區收集的24份種質資源進行分析，用UPGMA法將其分成4大類，其中浙江種源為一組，江西、廣西、湖北、湖南為一組，湖南懷化與廣西鐘山為一組，貴州種質單獨一組。表明ISSR分子標記適用于三葉青種質資源遺傳多樣性與親緣關系分析。從地理位置和相似系數分析，種質資源間親緣關系的遠近不全由地理距離決定，生態氣候、地形地貌、海拔、經緯度等自然因素及人類活動等社會因素均會影響親緣關系。符淵淼[6]將DNA條碼技術應用于三葉青及其近緣種的種質鑒定，確定了ITS及rbcL+matK+ITS是鑒定三葉青和其他近緣種的最佳條碼。分子生物學技術在三葉青種質鑒別中的應用研究尚不成熟，今后應加強種質資源收集，并且加快建立適合三葉青種質資源鑒別且使用可行的技術，以保護三葉青這一珍貴的藥用資源。

1.4 種質資源評價

黃真等[7]對廣西三葉青和浙江三葉青塊根性狀進行鑒別，結果顯示廣西三葉青個體較大，多數表面有皺紋，斷面粉紅色；而浙江三葉青個體較小，較圓整，光滑，斷面類白色。另外顯微鑒定顯示，兩者藥材性質也不相同，兩者浸出液中都含有黃酮類化合物、多糖和氨基酸，但對具體成分及藥效差別尚未研究。鄭軍獻等[8]用紫外可見分光光度法測定廣西和浙江的共10個樣本，結果表明，浙江產三葉青的總黃酮含量高于廣西產，浙江產中又以建德種源最高，常山次之，天臺第三，蘭溪最低。范世明等[9]對采自福建福安、順昌、泰寧、福鼎、柘榮等地的三葉青進行總黃酮含量測定，結果不同產地的三葉青塊根總黃酮含量存在明顯差異，其中福安和泰寧的三葉青總黃酮含量較高，且野生比人工栽培的總黃酮含量更高。楊雄志等[10]對分別在浙江樂清、舟山二地區和江西、福建、湖北、廣西等地采集的6個三葉青種源提取物進行研究發現，浙江樂清和舟山的三葉青提取物在解熱和對5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺含量影響方面都占有明顯優勢，這與鄭軍獻等[8]的測定結果基本一致。付金娥等[11]對浙江三葉青和廣西三葉青12種元素進行測定，發現除Zn、Cr、Pb外，其他9種元素浙江三葉青均高于廣西三葉青。目前，對不同種源三葉青有效成分含量并沒有系統的比較研究，從已有的研究可以看出，浙江種源三葉青從品質、藥效上都屬于比較好的。浙江省三葉青又可分很多不同種源，它們之間的優劣比較還有待進一步的研究探討。

2 繁育技術

2.1 扦插繁殖

浦錦寶等[12]采用500 mg·L-1生根粉溶液浸泡插穗切口1 h，然后與地面成35°～45°斜插于砂壤土中，實現了三葉青的人工扦插繁殖。吉慶勇等[13]對三葉青扦插繁殖技術進行研究，結果用1 000 mg·L-1IBA浸漬2～3年生三葉青老枝插條10 s后扦插于黃土中的繁殖效果較好。利用扦插手段進行三葉青繁殖操作比較簡單，目前，浙江省多地都通過這種方法來進行種苗繁育，多方比較顯示，扦插于裝有基質的容器中的效果要好于直接扦插在土中的對照，但這種方法不適用于大批量的種苗繁育。

2.2 組培快繁

鐘毓倩[14]對三葉青不同部位(莖尖、帶腋芽的莖段和葉片)的外植體進行誘導，在相同的滅菌處理下和同種培養基中，莖尖為最佳誘導外植體，同時認為MS+NAA 0.2 mg·L-1是最佳的增殖培養基。錢麗華等[15-16]均采用三葉青莖段腋芽為外植體實現了快速繁殖。邵駿驊等[17]以三葉青帶幼嫩腋芽莖段為外植體，成功建立了三葉青高效快繁技術體系，判定最佳增殖培養基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，最佳生根培養基為MS+IBA 0.5 mg·L-1。吳浩等[18]以不帶腋芽的莖段為外植體誘導愈傷組織，通過誘導組織脫分化形成不定芽，實現了三葉青人工繁殖，MS、B5培養基交替繼代方式有利于三葉青愈傷組織的繼代和分化。上述研究說明，三葉青組培快繁技術已趨向成熟，規?；S化育苗已基本可以實現。

2.3 仿野生栽培

毛麗花[19]在果園和蔬菜棚架下，采用袋式栽培和直接種植的方式進行三葉青栽培，發現袋式種植比大田和直接種植在地里的三葉青塊根更多，經濟效益更明顯。結合浙江省各地三葉青林下栽培情況，認為郁閉度為0.6以上，已采取墾復、撫育等較高強度經營管理措施的(半)常綠闊葉林、油茶林、香榧林等成齡林下，且土層厚度>30 cm，含腐殖質豐富的偏酸性土壤，坡度<30°排澇較好的山坡地較適合種植三葉青。

為防止水土流失，保護生態環境，提高產量，推薦以控根容器栽培為最佳。為了防止雜草，擺放控根容器區域林地實行帶墾或劈草后鋪設地膜。基質配方為33%林地腐殖質土或泥炭、16%紅壤，26%蛭石、8%珍珠巖、17%礱糠，堆漚發熱后才能使用。種植時間為每年的冬季和春季，要求隨起苗隨栽，避免苗根遭受風吹和日曬。

本課題組近幾年來對三葉青栽培技術進行研究，總結出一套包括選地、定植、田間管理、采收等在內的規范化栽培技術。

選擇土質疏松、肥沃、略呈酸性及排水良好的陰面山坡地，除草整地。選用苗高15～20 cm，帶有5～10條根的健壯種苗進行定植。定植應選在春季3月左右，此時日平均氣溫在10 ℃以上，地表溫度上升，無凍土，可有效防止低溫對種苗的傷害。定植時按株行距0.1 m×0.3 m種植，用手壓實并澆足定根水，使根系與土壤緊密結合。

期間應注意田間管理工作，及時中耕除草，為種苗創造一個疏松、通風的良好環境，并視土壤肥力情況適當施肥。在進行田間管理時，應注意避免傷及種苗根系，適時培土防止根系外露影響產量。三葉青病蟲害主要有葉斑病，可用65%代森鋅可濕性粉劑500～600倍液或1∶1∶150的波爾多液進行防治。在仿野生栽培三葉青過程中遮蔭是關鍵，應及時設置遮陽網，遮陽網遮蔽程度為70%左右。

三葉青地上及地下部分的生長主要集中在一年中的4—7月和9—11月，其他季節處于生長緩慢或休眠狀態。而10月中旬至11月下旬三葉青進入秋發期，此階段主要以地下塊莖的生長為主，基本占到全年生長量的80%。一般栽培3～4年即可收獲，采收一般在冬至前后，挖取根塊，除去泥土，洗凈，切片鮮用或曬干。藤條可回收用作育苗插穗。

三葉青塊根高產的關鍵：一是在做好田間管理的同時，控制好光照度和掌握好采收時間；二是合理施用肥料，調節土壤濕度。

3 小結

目前，對三葉青種質資源遺傳多樣性的研究主要從形態學、細胞學和分子水平等方面開展，結果均顯示，三葉青遺傳資源豐富，但這些研究結果之間缺乏有機的統一，對三葉青種質的品質評價一般根據塊根產量和總黃酮的含量來確定，缺乏對其功能性指標成分或分子指紋等方面的準確鑒定。因此，亟待構建一個完善、系統的三葉青種質鑒定、質量評價體系。繁殖栽培方面，不論是扦插繁殖還是組培繁殖都能滿足三葉青一直以野生資源入藥的現狀，仿野生栽培技術的研究能很好地保持野生三葉青優良的遺傳性狀。三葉青保護繁育工作意義重大，這不僅實現了珍貴中草藥三葉青的可持續發展，滿足人們對三葉青醫藥的需求，為三葉青產品的進一步研究和推廣建立基礎，也讓這一具有地方特色的藥用植物走出國門，更好地為人類健康醫學服務。

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