阿爾茨海默病模型大鼠腦海馬內MMP-9和TIMP-1 mRNA的表達

張 美 狄婷婷 徐樹雷 趙 夢 王瑞婷

(承德醫學院，河北 承德 067000)

阿爾茨海默病(AD)的特征表現為患者大腦皮層和海馬區的老年斑(SP)形成、神經纖維纏結(NFTs)及神經元丟失和凋亡〔1，2〕。目前，國內外研究總體認為Aβ是該病的使動因子，常以腦內注射Aβ的方法來制作AD動物模型〔3，4〕。基質金屬蛋白酶(MMPs)家族參與了許多疾病的病理生理過程，如心腦血管病、動脈粥樣硬化、癌癥、子宮內膜異位癥、關節炎、肺氣腫、腹主動脈瘤形成及細胞凋亡等〔5～7〕。MMPs在體內以無活性酶原形式存在，當存在鈣/鋅時，產生活性并作用于細胞外基質(ECM)，使基質降解〔8〕。研究表明AD患者血清MMP-9水平升高，推測與AD疾病嚴重程度相關，有可能為AD診斷提供參考〔9〕。內源性基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是MMPs的天然抑制因子〔10〕，TIMP-1活性最強，可特異性抑制MMP-9的活性。另外TIMPs還具有細胞生長因子樣作用，能使ECM沉積并抑制其降解〔11〕。本實驗探討AD病模型中兩者mRNA的水平。

1 材料與方法

1.1實驗動物及儀器 選擇雄性30只Wistar大鼠，10～12周齡，體重(250±20)g，SPF級別，動物合格證號：0289310，北京維通利華實驗動物技術有限公司〔許可證號：SCXK(京)2012-0001〕。主要試劑：Aβ25～35購自Sigma公司，高效液相色譜法檢測純度≥97%，Aβ25～351 mg干粉加500 μl無菌生理鹽水，制成母液2 g/L，-20℃冷凍存貯。臨用前，37℃溫箱孵育1 w，成凝聚態。實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit，RR820A，Lot：AK4505)，RNAiso Plus(9108Q，Lot：AK7602)，DEPC處置水(9013A，Lot：AA1801A)，反轉錄試劑盒(RR047A，Lot：AK3701)，購自大連寶生物工程有限公司；引物的合成由TaKaRa公司提供；腫瘤壞死因子(TNF)-α(EK3822，Lot：238231215)、白細胞介素(IL)-1β(EK301B2，Lot：2301B30241)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自聯科生物技術有限公司，其他試劑為分析純。第二軍醫大學的江灣Ⅰ型腦立體定位儀，瑞士Hamilton公司的微量進樣器，瑞士Mettler Toledo公司的AG245型電子分析天平，德國Startorius公司的BP211D精密電子天平，上海精宏實驗設備有限公司的DNP-9052型電熱恒溫培養箱，日本Sanyo公司的MDF-192型超低溫冰箱(-80℃)、低溫冰箱(-20℃)、SIM-F124型制冰機，德國Sigma公司的3-16PK冷凍離心機，美國Agilent 公司的Mx3000P型實時熒光定量PCR儀等。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組和處理 選取30只成年雄性Wistar 大鼠，按體重編號1～30，隨機分為A、B、C、D、E組，每組6只。分籠飼養，自然光照，自由飲水，標準飼料。A組大鼠雙側海馬CA1區注射無菌生理鹽水5 μl(即Aβ25～350 μg)，B、C、D、E組大鼠分別注射Aβ25～355 μl(分別含Aβ25～350.5、1.0、5.0、10.0 μg)，注射Aβ 14 d。

1.2.2制作AD模型 大鼠4%水合氯醛溶液麻醉后，將其固定在江灣Ⅰ型腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜進行腦立體定位海馬CA1區，按預試驗確定進針點進針，在10 min內用微量注射器向雙側海馬緩慢注入Aβ25～35或生理鹽水5 μl，留針5 min，緩慢拔針，縫合皮膚傷口，術后注射青霉素抗感染。

1.2.3血清制備及指標檢測 注射藥物或生理鹽水最后1 d，各組大鼠心臟取血于促凝離心管，室溫靜置0.5 h，2 500 r/min，10 min收集上清凍存-80℃冰箱。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，在30 min之內用酶標儀450 nm波長測定光密度(OD)值，繪制標準品擬合曲線，計算標本TNF-α、1L-1β含量。

1.2.4引物的設計與合成 以β-actin為內參照，在GenBank數據庫內查找MMP-9、TIMP-1的基因序列，利用Primer premier 5.0引物設計軟件進行引物設計，通過GenBank BLAST檢測同源性，設計出的引物分別由TaKaRa公司合成。β-actin正義鏈5′-TGACAGGAT GCAGAAGGAGA-3′，反義鏈5′-TAGAGCCACCAATCC ACACA-3′；MMP-9正義鏈5′-CGCTGACAAGAAGTGG GGTTT-3′，反義鏈5′-TACAGATGGTGGATGCCTTTTAT G-3′；TIMP-1正義鏈5′-CCTGGTTCCCTGGCATAATC-3′，反義鏈5′-CGCTCTGGTAGCCCTTCTC-3′。

1.2.5RNA的提取與轉錄 取血后，大鼠左心室快速灌注生理鹽水250 ml，然后灌注含4%多聚甲醛的磷酸鹽酸緩沖液(PBS-T)250 ml先快后慢，1 h后斷頭取腦內海馬，嚴格按照試劑盒說明書進行總RNA提取，紫外分光光度計檢驗RNA純度，要求波長在260/280處吸光值為1.8～2.2。嚴格按照RNA反轉錄試劑盒反轉cDNA，-80℃保存備用。

1.2.6Syber Green熒光定量PCR檢測 應用TaKaRa公司提供的實時熒光定量試劑盒，總反應體系25 μl，上下游引物各10 μl(10 μmol/L)，Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μl，DEPC水8.5 μl，最后加樣品cDNA 2 μl，混勻，離心，置熒光定量PCR儀中，預變性95℃，30 s，變性95℃，5 s，退火溫度MMP-9(51℃)、TIMP-1(48℃)，延伸72℃ 30 s，收集熒光信號，40個循環。采用SYBR法對MMP-9和TIMP-1 mRNA水平進行檢測。

1.2.7結果分析 擴增完畢，記錄結果CT值，利用2-△△CT方法進行分析。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組TNF-α、IL-1β水平比較 血清TNF-α含量D組(568.65±44.66)ng/L、E組(685.06±29.92)ng/L明顯高于A組(426.87±55.91)ng/L、B組(432.99±28.09)ng/L、C組(488.14±39.04)ng/L(均P<0.01)，且A、B組間差異無統計學意義(P>0.05)，B、C組間差異無統計學意義(P>0.05)，A組明顯低于C組(P<0.05)，D組明顯低于E組。血清IL-1β含量D組(104.60±9.32)ng/L、E組(143.38±17.09)ng/L明顯高于A組(49.13±8.46)ng/L、B組(60.89±14.71)ng/L、C組(79.81±9.94)ng/L(P<0.01)，且C組明顯高于A組(P<0.01)，D明顯低于E組(P<0.05)。

2.2各組MMP-9、TIMP-1 mRNA水平比較 qRT-PCR結果顯示，MMP-9 mRNA表達D組(4.269 6±1.489 1)、E組(7.801 6±1.258 3)明顯高于B組(1.469 6±0.308 2)、C組(1.837 1±0.412 2)和A組(1.000 0±0.000 0)，D組明顯低于E組(P<0.01)，A、B、C三組之間差異無統計學意義(P>0.05)。TIMP-1 mRNA表達D組(3.453 0±0.892 6)、E組(5.526 9±1.371 7)組明顯高于A組(1.000 0±0.000 0)、B組(1.131 4±0.114 3)和C組(1.390 5±0.141 9)(P<0.01)，D組明顯低于E組(P<0.01)，A、B、C組間差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

本實驗制作經典癡呆模型，炎癥因子TNF-α、IL-1β明顯升高，證實癡呆模型制作成功。AD主要是Aβ在神經元附近聚集形成SP，胞內產生纖維纏結，tau蛋白磷酸化，小膠質細胞被激活并且釋放炎癥因子，從而導致神經元損傷。因此降解Aβ使其在大腦中的堆積減少對緩解AD有著重要作用。研究發現MMP對機體不同組織的發育和修復、腫瘤發生發展，尤其在炎癥反應中起重要作用〔12，13〕。MMP-9的作用底物是Ⅳ膠原、纖連蛋白、層黏連蛋白等〔14〕，因此預測對AD患者腦內堆積的Aβ沉積有一定的降解功能。MMP-9在胞外可被特定的蛋白酶TIMP-1特異性結合。TIMP-1作為MMP-9的特異性內源抑制因子，在生理條件下和MMP-9形成1∶1的復合物，并切割MMP-9使其被激活。本實驗顯示MMP-9與TIMP-1之間存在動態平衡關系，且隨著Aβ濃度增加，兩者mRNA的表達含量都不斷增加。當Aβ達到5.0 μg和10.0 μg濃度時，MMP-9、TIMP-1 mRNA水平明顯升高，推測兩者可能參與到Aβ25～35所致的大鼠模型炎性反應中，并且根據已有的實驗推測MMP-9對胞外的Aβ進行一定程度上降解。具體降解量在什么水平，還要進一步實驗證實。本實驗表明MMP-9和TIMP-1確實在AD中有相應的改變，即隨Aβ劑量增大，表達逐漸增加，但是否可作為診斷AD的特征指標，還有待進一步探究。本實驗的不足是AD模型的建造雖屬于經典造模方法，但由于對動物注射Aβ的行為也會造成腦組織局灶性穿透性損傷，且Aβ聚集于注射位點而不是彌散于腦內〔15〕，對實驗結果分析也會造成一定誤差，因此操作技術還需進一步完善。

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