細胞自噬及其在危重病發展進程中的作用

林雪容 趙自剛 李福龍 牛春雨

(河北北方學院微循環研究所，河北 張家口 075000)

細胞自噬涉及溶酶體降解和細胞質成分的回收，是近年來發現的細胞程序性死亡(PCD)途徑的重要介質。與PCD相似，自噬一方面能清除衰老細胞、腫瘤細胞，發揮積極的保護作用，故自噬功能低下可能參與了癌癥、神經退行性病變等發病過程〔1,2〕；另一方面，過度的細胞自噬則是導致細胞死亡、組織壞死、器官損傷的重要因素〔3～5〕。嚴重創傷、失血、大手術、感染、缺血再灌注等引起休克、膿毒癥，影響著患者的預后。在這一過程中，細胞過度死亡或功能障礙是其重要的發病學基礎；由于細胞自噬特殊的病理生理意義〔6〕，細胞自噬在危重病發展進程中作用值得關注。本文探討細胞自噬在危重病發展中的病理生理作用。

1 細胞自噬

1.1自噬的基本過程 在自噬過程中，涉及細胞質蛋白、細胞器或病原體的膜泡封存，導致雙膜小泡的形成，稱為自噬體；隨后，融合了溶酶體的自噬體形成自噬溶酶體，其中捕獲的材料與內膜一起被降解〔2〕。自噬引起細胞的形態學特征表現為空泡、胞質內容物退化和小染色質濃縮〔7〕。一般來說，從形態學上，自噬可分為4個階段〔5,8〕。①初始階段：在饑餓、氧化應激、缺血缺氧等病理狀態時，可激活Ⅰ類和Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)誘導自噬；②自噬體的形成階段：在自噬相關蛋白Beclin1基因〔也稱為自噬相關基因(ATG)〕12/ATG5和ATG8泛素化系統的參與下，將自噬體相關蛋白——微管相關蛋白1輕鏈(LC)3轉變成 LC-Ⅱ并與ATG12-ATG5-ATG16C在自噬體膜表面結合，形成自噬體〔9〕；③自噬體的運輸階段：將自體自噬體運送至溶酶體的過程，但具體機制還不十分清楚；④自噬體的裂解階段：運輸至溶酶體的自噬體，在小G蛋白Rab7三磷酸鳥苷(GTP)酶及溶酶體相關膜蛋白(LMAP)1/2的誘導下，自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體，進而在溶酶體酶的作用下將其中捕獲的材料與內膜一起被降解，隨后供機體再回收、再利用〔10〕。

1.2自噬的檢測方法 自噬體第一次是在電鏡下被檢測到的，因此，檢測自噬的金標準是通過透射電鏡發現膜狀結構的自噬體及其他相關亞細胞結構，如自噬小體、自噬溶酶體、自噬內涵體等〔11～13〕。但受實驗方法學的影響，與凋亡小體類似，已經發生自噬的細胞在透射電鏡下不一定能準確發現其相關的結構變化。目前，文獻最常用的方法是蛋白印跡技術檢測自噬標志物LC3的轉換(LC3-Ⅱ/LC3-I)及熒光顯微鏡檢測LC3點狀聚集物的形成情況；由于LC3本身也最終經溶酶體降解，因此在檢測LC3時，往往需要結合一些溶酶體抑制劑聯合檢測〔11,12,14〕。

1.3自噬的引發因素 低基礎水平的自噬發生在所有的細胞和內環境穩態中；當細胞需要擺脫細胞質成分的損壞或消除由于氧化應激、感染、缺血-再灌注等因素引起自身受損的細胞器(如線粒體)，自噬迅速上調；而營養狀況、激素(包括性激素)水平、溫度、氧分壓和細胞密度等因素均對調節細胞自噬發揮重要的作用〔2〕。因此，細胞自噬既是致病因素導致疾病發生過程中的一個現象，又是致病因素引起疾病的一個推進因素，自噬水平的高低對其發展發揮著重要作用。

1.4自噬的調節 自噬是一個復雜的信號網絡相互作用的結果，各種刺激信號均可以調控哺乳動物的細胞自噬〔15,16〕。雷帕霉素靶位(TOR)是絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過整合Ⅰ型PI3K和氨基酸依賴性信號傳導途徑調節自噬；蛋白激酶(PK)B是小G蛋白Ras家庭富集在腦的同源蛋白(RHEB)GTP酶，其磷酸化可抑制結節性硬化癥(TSC)1～2，激活TOR，抑制自噬；激活胰島素受體可刺激Ⅰ型PI3K和小GTP酶Ras復合體，從而激活了PI3K-PKB-TOR途徑；氨基酸通過抑制Raf-1-絲裂原活化細胞外調節激酶(MEK)1/2-細胞外信號調節激酶(ERK)1/2的信號級聯，抑制自噬；能量耗盡會導致AMP活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化，激活肝細胞激酶(LK)B1或TSC相關基因TSC1產物TSC1-TSC2，使TOR失活，激活自噬；p70 S6激酶作為TOR的底物，可反饋調節TOR的活動，確保自噬的基礎水平，這對于內環境的穩態十分重要；c-Jun氨基末端激酶(JNK)1和死亡相關蛋白激酶(DAPK)磷酸化和擾亂抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的饑餓，與ATG有關，這都會導致的Beclin 1相關Ⅲ型PI3K復合體和自噬的激活〔16〕。內源性非編碼小RNA(miRNA)分子，在參與細胞生長發育的同時，多數可通過抑制細胞自噬形成過程的不同階段，抑制細胞自噬，參與細胞自噬的調節〔17～19〕。此外，泛素樣蛋白系統也參與細胞自噬的調控。

2 細胞自噬在危重病發展進程中的病理生理作用——雙刃劍

2.1細胞自噬的保護作用 自噬的促存活作用已在細胞、組織水平的不同背景下被證實了，這包括缺血再灌注、微生物感染引起的膿毒癥等多種病理過程。研究〔20〕發現，在盲腸結扎穿孔(CLP)導致小鼠肺、肝、腎等器官損傷的同時，引起了炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6釋放增多、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值抬高，提示自噬增多；青藤堿鹽酸鹽(SIN-HCl)降低了CLP誘導的器官損傷與功能障礙，降低了炎癥因子釋放，但增加了肝、肺、腎組織細胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達；進一步應用腹腔巨噬細胞(PM)的研究顯示，SIN-HCl降低了脂多糖(LPS)引起的TNF-α、IL-6釋放增多，進一步增加了PM中自噬體的數量；細胞自噬與CLP引起的器官損傷有關，SIN-HCl降低CLP導致細胞損傷的機制是部分通過增加細胞自噬實現的。Yan等〔21〕研究發現，長期慢性心肌缺血(30%動脈狹窄)再灌注后，心肌細胞自噬增加，反映在與自噬相關的蛋白高表達，如組織蛋白酶D、組織蛋白酶B、熱休克同源蛋白(Hsc)73、Beclin1及LC3；同時，在6次缺血再灌注后的心肌細胞凋亡減少，研究提示心肌細胞通過自噬的作用來抑制細胞凋亡，從而減少心肌毒性作用。這些研究表明，一定程度上增加的細胞自噬對危重狀態下的組織、器官具有一定的保護作用。

2.2細胞自噬的損傷作用 目前，研究〔22～25〕發現細胞自噬參與了多種因素引起的組織損傷。在一個70%缺血的肝缺血再灌注模型上，在再灌注后的4、8、16 h均出現了反映肝功能的血清生化指標異常及肝組織學損傷，細胞凋亡與自噬增加；不同劑量的丙酮酸乙酯則不同程度地減輕了肝損傷，降低了Bax與LC3表達，抑制了肝細胞細胞凋亡與自噬，其作用機制與抑制高遷移率族蛋白(HMG)B1/Toll樣受體(TLR)4/核轉錄因子(NF)-κB通路及降低炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放有關〔22〕。在同樣的模型上，Wang等〔23〕發現，N-乙酰半胱氨酸(NAC)治療能夠降低肝損傷，下調Beclin1與LC3表達，降低JNK、p-JNK、Bax、TNF-α、NF-κB、IL-2、IL-6的表達水平，提示NAC抑制細胞凋亡與自噬作用是通過下調JNK信號實現的。在失血性休克液體復蘇后引起肝臟缺血再灌注損傷的模型上發現，氧化應激引起的半胱天冬蛋白酶(Caspase)1活化通過上調自噬啟動蛋白Beclin1表達增加自噬，從而引起肝細胞的炎癥反應與損傷〔24〕。在細胞水平上，Xu等〔25〕研究發現，LPS處理可誘導巨噬細胞的自噬增加，應用小干擾RNA(siRNA)抑制Beclin1基因表達，使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤或PI3K抑制劑渥曼青霉素，均可抑制LPS引起的自噬增加。這些研究表明，過度的細胞自噬是嚴重致病因素引起組織細胞損傷的重要機制。

綜上，多種因素均可誘導細胞自噬，多條信號通路參與了細胞自噬的調控；細胞自噬在危重病發展的不同階段具有不同的作用，以調控自噬為靶點，對于減輕組織細胞損傷具有一定的意義，這也可能成為將來防治危重病的一個新的研究方向。目前，對于創傷失血性休克的救治，不論是在臨床工作中還是在實驗室研究中，液體復蘇均為首選措施，不同液體復蘇方式也產生了不同的效果，如果以細胞自噬為關注點，探討不同液體復蘇方式對于休克的治療效果，也是今后的研究重點。

1Benbrook DM,Long A.Integration of autophagy,proteasomal degradation,unfolded protein response and apoptosis〔J〕.Exp Oncol,2012;34(3):286-97.

2Levine B,Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease〔J〕.Cell,2008;132(1):27-42.

3Takabatake Y,Kimura T,Takahashi A,etal.Autophagy and the kidney:health and disease〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2014;29(9):1639-47.

4Ryter SW,Choi AM.Autophagy in the lung〔J〕.Proc Am Thorac Soc,2010;7(1):13-21.

5Sureshbabu A,Ryter SW,Choi ME.Oxidative stress and autophagy:crucial modulators of kidney injury〔J〕.Redox Biol,2015;4:208-14.

6Todde V,Veenhuis M,van der Klei IJ.Autophagy:principles and significance in health and disease〔J〕.Biochim Biophys Acta,2009;1792(1):3-13.

7Bursch W.The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death〔J〕.Cell Death Differ,2001;8(6):569-81.

8Zou Z,Wu L,Ding H,etal.MicroRNA-30a sensitizes tumor cells to cis-platinum via suppressing beclin 1-mediated autophagy〔J〕.J Biol Chem,2012;287(6):4148-56.

9Russell RC,Tian Y,Yuan H,etal.ULK1 induces autophagy by phosphorylating Beclin-1 and activating VPS34 lipid kinase〔J〕.Nat Cell Biol,2013;15(7):741-50.

10Korkmaz G,le Sage C,Tekirdag KA,etal.MiR-376b controls starvation and mTOR inhibition-related autophagy by targeting ATG4C and BECN1〔J〕.Autophagy,2012;8(2):165-76.

11Klionsky DJ,Abeliovich H,Agostinis P,etal.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes〔J〕.Autophagy,2008;4(2):151-75.

12Klionsky DJ,Abdalla FC,Abeliovich H,etal.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy〔J〕.Autophagy,2012;8(4):445-544.

13Mizushima N,Yoshimori T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research〔J〕.Cell,2010;140(3):313-26.

14Sarkar S,Perlstein EO,Imarisio S,etal.Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington′s disease models〔J〕.Nat Chem Biol,2007;3(6):331-8.

15Yang Z,Klionsky DJ.Eaten alive:a history of macroautophagy〔J〕.Nat Cell Biol,2010;12(9):814-22.

16李樂興,戴漢川.細胞自噬調控的分子機制研究進展〔J〕.中國細胞生物學學報,2015;37(2):263-70.

17Frankel LB,Wen J,Lees M,etal.microRNA-101 is a potent inhibitor of autophagy〔J〕.EMBO J,2011;30(22):4628-41.

18Qi L,Zhang Y.The microRNA 132 regulates fluid shear stressinduced differentiation in periodontal ligament cells through mTOR signaling pathway〔J〕.Cell Physiol Biochem,2014;33(2):433-45.

19Shi G,Shi J,Liu K,etal.Increased miR-195 aggravates neuropathic pain by inhibiting autophagy following peripheral nerve injury〔J〕.Glia,2013;61(4):504-12.

20Jiang Y,Gao M,Wang W,etal.Sinomenine hydrochloride protects against polymicrobial sepsis via autophagy〔J〕.Int J Mol Sci,2015;16(2):2559-73.

21Yan L,Vatner DE,Kim SJ,etal.Autophagy in chronically ischemic myocardium〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2005;102(39):13807-12.

22Shen M,Lu J,Dai W.Ethyl pyruvate ameliorates hepatic ischemia-reperfusion injury by inhibiting intrinsic pathway of apoptosis and autophagy〔J〕.Mediators Inflamm,2013;2013:461536.

23Wang C,Chen K,Xia Y,etal.N-acetylcysteine attenuates ischemia-reperfusion-induced apoptosis and autophagy in mouse liver via regulation of the ROS/JNK/Bcl-2 pathway〔J〕.PLoS One,2014;9(9):e108855.

24Sun Q,Gao W,Loughran P,etal.Caspase 1 activation is protective against hepatocyte cell death by up-regulating beclin 1 protein and mitochondrial autophagy in the setting of redox stress〔J〕.J Biol Chem,2013;288(22):15947-58.

25Xu Y,Fattah EA,Liu XD,etal.Harnessing of TLR-mediated autophagy to combat mycobacteria in macrophages〔J〕.Tuberculosis(Edinb),2013;93(1):S33-7.