二化螟生理生化與分子生物學研究進展

徐剛，葉恭銀

(1.浙江大學昆蟲科學研究所水稻生物學國家重點實驗室 農業農村部作物病蟲分子生物學重點實驗室，浙江 杭州 310058;2.揚州大學 園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225009)

二化螟(Chilosuppressalis)在亞洲、北非和南歐是最重要的水稻害蟲之一。二化螟幼蟲在水稻葉鞘和莖稈內鉆蛀為害，形成枯心、白穗及蟲傷株等[1]。在中國，二化螟每年都能造成嚴重的生產損失，化學防治目前依然是主要的防治手段，但是二化螟已對多種農藥產生抗性[2]。二化螟基因組測序、轉錄組測序和小RNA測序的不斷完成，為研究二化螟生理生化特性和基因功能提供了堅實的基礎。CRISPR/Cas9技術在二化螟中已得到成功應用[3]，將為今后二化螟基因功能的解析、開辟二化螟新型防控技術提供堅實的技術支撐。為此，本文就近年來有關二化螟基因組及功能基因、抗藥性、對Bt抗性的分子機制、神經受體、嗅覺相關基因、熱休克蛋白，以及被寄生蜂調控等相關研究的最新進展進行概述。

1 二化螟基因組及功能基因

隨著組學及相關技術的迅速發展，二化螟基因組及功能基因組研究也得以發展。在完成二化螟基因組測序的基礎上，二化螟基因組數據庫ChiloDB已構建。該數據庫收錄了二化螟的基因組、轉錄組和小RNA數據，為二化螟研究提供了開放的數據平臺[4-5]。另外，二化螟的中腸、脂肪體、血細胞、觸角、信息素分泌腺和神經系統等不同組織的轉錄組測序[6-11]也為二化螟功能基因研究提供了基礎。基于基因組和轉錄組數據，二化螟的類胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[12]、類絲氨酸蛋白抑制劑[13]、類半胱氨酸蛋白酶[14]、P450[15]和幾丁質酶[16-17]等基因家族被鑒定分析，這些研究為深入解析各家族基因的功能奠定了很好的大數據基礎。

2 二化螟抗藥性機理

使用殺蟲劑仍是防治二化螟最重要的手段，持續使用單一殺蟲劑會導致二化螟抗性的快速發展，因此監測殺蟲劑抗性將為二化螟的綜合防治提供必要的信息。2010—2012年，研究人員調查了我國7省55個二化螟田間種群對雙酰胺類殺蟲劑的敏感性，發現大多數種群對氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺仍處于敏感水平階段，只有少數種群對這2種雙酰胺類殺蟲劑表現出低到中等水平的抗性，如浙江象山和浙江蒼南二化螟田間種群對氯蟲苯甲酰胺表現出低水平抗性，湖北武穴種群對氯蟲苯甲酰胺表現出中等水平抗性[18-19]。另有研究發現，江蘇儀征、湖南東安、浙江象山及江西上高等田間種群對氟苯蟲酰胺表現出低水平抗性(5.1～9.3倍)，浙江金華種群對氟苯蟲酰胺產生了11.8倍的中等水平抗性[20]。2015年，在我國7省開展的19個二化螟田間種群對氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺的抗藥性檢測發現，浙江象山種群對氯蟲苯甲酰胺表現87.9倍的中等水平抗性，浙江蒼南和余姚種群分別表現135倍和141.1倍的高水平抗性，這3個地區的種群對氟苯蟲酰胺都表現為中等抗性(15～58.7倍)[21]，說明上述地區的二化螟可能已經對雙酰胺類殺蟲劑產生了較高水平的抗性。可見加強抗藥性監測及有關機理研究很有必要。

關于二化螟對新型藥劑抗性的機理研究也取得了一定進展。魚尼丁受體(RyR)被認為是二酰胺類殺蟲劑的作用靶標，二化螟的RyR已成功地被克隆分析[22-23]。在對氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺的抗性分別達到77.6倍和42.6倍的二化螟種群中，Yao等[2]檢測到RyR第4 946位的甘氨酸(G)突變為谷氨酸(E)(G4946E)。先前在小菜蛾上的研究表明，RyR的G4946E突變會導致藥劑與受體的結合能力下降，這是其對雙酰胺類殺蟲劑產生抗性的重要機制[24]。增效試驗發現，二化螟對雙酰胺類殺蟲劑的抗性與3種解毒酶[P450、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和酯酶(EST)]沒有明顯的相關性。然而，Lu等[25]發現，G4946E突變與二化螟對氯蟲苯甲酰胺的抗性沒有顯著的相關性，認為可能是EST在二化螟對氯蟲苯甲酰胺產生抗性的過程中發揮作用。Sun等[26]在氯蟲苯甲酰胺二化螟抗性種群中發現了RyR一個新的突變Y4667D，而另一個保守的突變I4758M發生的頻率達到94.4%。與敏感種群相比，氯蟲苯甲酰胺抗性種群中RyR的mRNA表達水平顯著下降。使用氯蟲苯甲酰胺處理之后，所有種群的RyR表達水平均會下降到50%左右。增效評估和酶活試驗顯示，EST和P450可能參與了二化螟對氯蟲苯甲酰胺的抗性。同時，Xu等[27]發現，P450基因CYP6CV5、CYP9A68、CYP321F3和CYP324A12在二化螟對氯蟲苯甲酰胺抗性種群中顯著高表達，RNAi試驗也證實這些P450基因參與了二化螟對氯蟲苯甲酰胺的抗性。亞致死濃度的氯蟲苯甲酰胺可以延緩二化螟的發育、降低其繁殖力，卵黃蛋白(Vg)的表達水平也隨之下降[28]。同時，亞致死濃度的氯蟲苯甲酰胺也可以誘導二化螟保幼激素(JH)合成基因(JHAMT、FPPS1和FPPS2)表達水平上升，進而提高JH濃度[29]。

3 二化螟Bt相關受體蛋白

二化螟是轉Bt基因水稻的一個重要靶標害蟲，其中，蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)的殺蟲晶體蛋白Cry通過結合靶標昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)上的特異受體發揮其殺蟲活性。通過配體印跡和質譜方法，在二化螟中腸中鑒定到了可能的Cry1Ab毒素受體蛋白氨肽酶(APN)，從二化螟中腸克隆得到APN不同基因型的全長，通過RNAi干擾掉APN1、APN3a和APN5，降低了二化螟幼蟲取食轉Cry1Ab水稻的死亡率[30]。同時，另一篇研究顯示，干擾掉APN1和APN2，取食轉Cry1Ab和Cry1Ac融合基因的水稻TT51和轉Cry1Ca基因的水稻T1C-19，二化螟幼蟲的死亡率顯著降低[31]。鈣黏蛋白(CAD)是一類鈣離子依賴的細胞黏附蛋白，被認為是Cry蛋白的受體之一[32]。通過喂食siRNA降低二化螟CAD1和CAD2的表達，再取食轉Cry2A和Cry1C的水稻，幼蟲的死亡率下降[33]。堿性磷酸酶(ALPs)在鱗翅目中被認為與Cry蛋白的毒性有關[34]。在二化螟中有6個ALP(ALP1～6)，通過喂食雙鏈RNA的方法干擾掉不同的ALP，結果顯示，干擾掉ALP1、ALP2和ALP4能顯著降低二化螟幼蟲對轉Cry1Ab/Cry1Ac水稻的敏感性，干擾掉ALP1、ALP2、ALP3、ALP4和ALP6能降低二化螟對轉Cry2Aa水稻的敏感性，干擾掉ALP1、ALP2、ALP3、ALP4和ALP5顯著增強二化螟對轉Cry1Ca水稻的抗性[35]。研究表明，活化蛋白激酶(MAPK)p38的磷酸化能提高二化螟對Cry毒素的抗性[36]，在二化螟中干擾掉p38，取食轉Cry1Ca的水稻或摻入Cry1Ca蛋白的人工飼料，幼蟲的死亡率顯著上升[37]，由此可見，MAPK p38能增強二化螟對Cry1Ca的抗性。

4 二化螟神經受體

神經遞質是化學突觸傳遞中的信使，在突觸前末梢通過不同的合成酶作用產生，通過胞吐作用釋放到突觸間隙，隨后與位于突觸后膜上的神經受體互作，調控不同的生理與行為過程。通過對二化螟中樞神經系統進行轉錄組測序，解析了二化螟的神經遞質信號系統，包括章魚胺(OA)、酪胺(TA)、多巴胺(DA)、5-羥色胺、組胺、谷氨酸、乙酰膽堿和γ-氨基丁酸(GABA)[9]。通過構建神經受體的真核表達載體，將其在哺乳動物細胞系(HEK-293)中穩定表達，解析了二化螟生物胺受體的藥理學特性，包括章魚胺受體OA1[38]、OA2B2[39]和OA3[40]，酪胺受體TA1[41]和TA2[42]，多巴胺受體DOP1、DOP2和DOP3[43]。OA1和DOP2偶聯Gs和Gq蛋白，引起胞內cAMP和Ca2+濃度上升[38, 43]；OA2B2和DOP1偶聯Gs蛋白，引起胞內cAMP濃度的上升[39, 43]；OA3、TA1和DOP3偶聯Gi蛋白，導致胞內cAMP濃度下降[40-41, 43]；TA2偶聯Gq蛋白，引起胞內Ca2+濃度上升[42]。生物胺不僅在神經調控中發揮重要作用，而且參與免疫反應[44-45]。免疫熒光顯示，生物胺受體OA1、TA2和DOP1在二化螟的血細胞上有表達[38, 42, 46]。一系列研究發現，OA可能通過OA1受體調控血細胞的延展和吞噬[38]，TA可能通過TA2受體調控血細胞的延展[42]，而DA可能通過DOP1受體調控血細胞的吞噬[46]。通過轉錄組測序，在二化螟中鑒定到了12個煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)，其中，α型9個、β型3個[47]。GABA受體是重要的農藥靶標之一，研究人員在二化螟中克隆和分析了GABA受體的2個亞型RDL1和RDL2，將其在爪蟾卵母細胞(Xenopusoocytes)中表達，發現第2個跨膜區的2’位置的絲氨酸能影響RDL對地特靈的敏感性，但不會影響對氟蟲腈和氟雷拉納的敏感性[48]。在昆蟲中，神經肽通過特異地結合其神經肽受體調控生理與行為過程，研究人員在二化螟中鑒定到了43個神經肽基因和51個神經肽受體基因，并借助定量PCR分析了這些基因在中樞神經系統、脂肪體、腸道和血細胞中的表達，發現大部分均在神經系統顯著高表達[49]。

5 二化螟嗅覺相關基因

二化螟觸角的轉錄組測序鑒定了嗅覺相關基因，包括47個氣味受體(ORs)、20個離子通道型受體(IRs)、20個氣味結合蛋白(OBPs)、4個信息素結合蛋白(PBPs)、2個一般氣味結合蛋白(GOBPs)、21個化學感受蛋白(CSPs)和2個感覺神經元膜蛋白(SNMPs)[8]。后來，從二化螟的基因組數據中，研究人員又鑒定出15個新的OBPs[50]。熒光競爭結合試驗發現，OBP8對β-紫羅酮、橙花叔醇、法尼醇和2-已酮有很強的結合親和力[50]，GOBP1對法尼醇和油酸有很強的結合親和力，而GOBP2對雪松醇、法尼醇、月桂烯、β-紫羅酮和亞麻油酸有很好的結合親和力[51]。通過在爪蟾卵母細胞(Xenopusoocytes)中表達，發現PBP能增強信息素受體(PRs)對性信息素的敏感性[52]。借助CRISPR/Cas9技術，研究人員成功構建了PBP1和PBP3的敲除突變體[3]，這也是在二化螟中首次通過CRISPR/Cas9實現基因突變。通過自交得到PBP1和PBP3的純合突變體，觸角電位反應(EAG)試驗顯示，PBP1的純合突變體對性信息素的電生理反應比PBP3降低得更多，表明PBP1可能扮演著更加重要的作用[3]。

6 二化螟miRNA

miRNA是一類小的、非編碼的RNA，通過降解mRNA的轉錄或抑制翻譯下調其靶標基因，主要作用于其轉錄本的3’端[53]。通過小RNA測序，在二化螟中鑒定到300個miRNA，芯片分析表明,在變態發育過程中有54個差異表達的miRNAs[54]。靶標預測和體外的雙熒光素報告試驗顯示，有7個miRNA(miR-9b、novel-260、Bantam、novel-154、novel-80、novel-89和novel-257)協同調控蛻皮激素合成通路中的3個Halloween基因(Neverland，Disembodied和Spook)，過表達這7個miRNA會降低20-羥基蛻皮激素(20E)的滴度，導致二化螟死亡率上升和發育遲緩，說明通過20E處理可以進行拯救[54]。通過人工miRNA表達技術，將13個新型的二化螟內源miRNA在水稻中過表達，喂食試驗顯示，其中2個miRNA能夠顯著地抑制二化螟幼蟲的生長，當幼蟲持續取食過表達miR-15的轉基因水稻，其化蛹時間推后了4 d[55]。另外，在二化螟中鑒定到一個昆蟲特有的miRNA(miR-14)，預測其靶標基因為蛻皮激素信號網絡中的2個關鍵基因Spook和蛻皮激素受體(EcR)，雙熒光素報告試驗表明，miR-14與Spook和EcR存在互作關系，miR-14在二化螟每個幼蟲齡期的末段高表達，且與2個靶標基因的表達負相關[56]。在5齡幼蟲中注射miR-14的類似物，會引起二化螟致死和畸形現象。將miR-14轉到水稻中，喂食試驗顯示，表達miR-14的轉基因水稻對二化螟有很高的抗性[56]。這些研究表明，miRNA可作為害蟲防治的潛在靶標，而且，將昆蟲特有的miRNA用于害蟲治理，也可回避對非昆蟲物種的傷害。

7 二化螟熱休克蛋白

熱休克蛋白(HSPs)是細胞或生物體受到環境脅迫或有害刺激后合成的一類遺傳上高度保守的蛋白，參與蛋白質的合成、折疊和轉運等，發揮分子伴侶的作用[57]。根據分子量不同，熱休克蛋白可分為熱休克蛋白90(HSP90)、熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白60(HSP60)和小分子熱休克蛋白(sHSP)[57]。非滯育的二化螟幼蟲在冷刺激下，hsp90的表達水平上升[58]，從28～-14 ℃梯度降溫處理滯育的二化螟幼蟲，發現hsp90的表達量在0 ℃時最高[59]。二化螟hsp70基因能被熱脅迫誘導表達，幼蟲血淋巴細胞中的hsp70基因在36 ℃時mRNA表達水平最高，且其蛋白表達水平與mRNA表達水平一致[60]。二化螟5齡幼蟲在28～39 ℃處理下，hsp60基因能被熱脅迫誘導表達，且在36 ℃時mRNA和蛋白表達水平均最高[61]。Lu等[62]檢測了二化螟hsp90、hsp70和hsp60的時空表達，發現均在后腸表達量最高、在前腸表達量最低，且在頭部表達均較高。hsp90和hsp70在二化螟不同發育時期均有表達，而hsp60在雌成蟲中的表達量顯著高于雄成蟲[62]。hsp90、hsp70和hsp60對熱脅迫的敏感性均高于冷脅迫，分別在42、36、36 ℃表達量最高[62]。Lu等[63]和Pan等[64]在二化螟中克隆分析了7個sHSP，包括hsp19.8、hsp21.4、hsp21.5、hsp21.7a、hsp21.7b、hsp22.9b和hsp24.3，其中hsp19.8、hsp21.5、hsp21.7a和hsp21.7b在馬氏管或后腸表達量最高，hsp21.4在頭部高表達[63]，hsp22.9b和hsp24.3在脂肪體表達最高，在后腸和馬氏管表達最低[64]。hsp19.8、hsp21.7b、hsp22.9b和hsp24.3均能被熱脅迫和冷脅迫誘導，hsp21.5可以被冷脅迫誘導，而hsp21.4和hsp21.7a對熱脅迫和冷脅迫均無響應[63-64]。

8 二化螟被二化螟盤絨繭蜂調控

二化螟盤絨繭蜂Cotesiachilonis是二化螟幼蟲期的優勢寄生蜂，對二化螟的田間防控作用明顯[65]。二化螟盤絨繭蜂寄生能引起二化螟幼蟲血細胞數量、延展、存活、吞噬、包囊，以及血淋巴酚氧化酶活性等的變化[1]。Teng等[66]發現，血細胞總數在被寄生的二化螟幼蟲后期比未寄生的更高，而血細胞死亡率、漿細胞和顆粒細胞的比例均不受影響。二化螟盤絨繭蜂整個發育期，二化螟血細胞的延展都能被寄生顯著地抑制，二化螟盤絨繭蜂寄生可以在早期抑制二化螟的包囊反應和黑化[66]。二化螟盤絨繭蜂的毒液不能直接改變二化螟的細胞免疫反應，但可以通過降低黑化抑制二化螟的體液免疫。與毒液相比，二化螟盤絨繭蜂的萼液對血細胞延展、包囊和黑化有顯著作用。劑量注射試驗顯示，毒液和萼液協同作用比單一使用可以更強更持久地控制二化螟的免疫反應[66]。轉錄組測序發現，二化螟盤絨繭蜂寄生能影響二化螟脂肪體和血細胞的基因表達，其中，8 096個脂肪體基因和5 743個血細胞基因表達下調，2 572個脂肪體基因和1 452個血細胞基因上調，且大部分差異表達基因與酶活調控、轉錄調控和催化活性等有關[7]。

9 展望

近年來，二化螟生理生化與分子生物學領域取得了較大的進展。二化螟數據庫ChiloDB的構建，為二化螟研究提供了開放的數據平臺。利用RNAi技術，許多基因的功能被鑒定解析，使得探討其作為靶標在防治二化螟中的作用成為可能。一些特定miRNA的轉基因水稻對二化螟有很高的抗性，這為防治二化螟提供了新的思路。借助CRISPR/Cas9技術，研究人員成功構建了二化螟的突變體。隨著高通量測序和分子生物學技術的不斷成熟，二化螟生理生化與分子生物學研究將不斷深入，將有更多的功能基因和分子調控機制被解析，這些進展也將會為防治二化螟提供新思路和新手段。