多藥耐藥基因MDR1和細胞自噬在腫瘤多重耐藥機制中的研究進展*

柳丹，李珊，趙紅艷，柯鏡，湯志明，白磊，牛成群，牟雪瑤，朱明明，武福云

（湖北醫(yī)藥學院 基礎醫(yī)學研究所，湖北 十堰 442000）

我國惡性腫瘤的死亡率居高不下，腫瘤耐藥現(xiàn)象最早在上世紀40年代被發(fā)現(xiàn)。腫瘤細胞接觸一種化療藥物后很快會產(chǎn)生耐藥，且同時對多種結(jié)構(gòu)和作用機制不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥，其稱為腫瘤的多藥耐藥性[1]。腫瘤細胞多藥耐藥是臨床化療藥物效果欠佳的主要原因，其導致腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移。大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的多藥耐藥分子機制涉及多個進程（如藥物攝取減少、外排增加、改變藥物代謝、增強DNA損傷修復及抗凋亡的產(chǎn)生等），但其具體機制到目前為止還不清楚。P-糖蛋白是由多藥耐藥基因（multidrug resistance 1 gene,MDR1）編碼，在多種腫瘤細胞中高表達（如腎癌、結(jié)腸癌和腎上腺腫瘤等[2]）。多種化療藥物可通過結(jié)合P-糖蛋白的不同位點而被排出細胞外，從而產(chǎn)生耐藥[3]。除P-糖蛋白外還有2個主要的耐藥蛋白：腫瘤多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1,MRP1）和乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP/ABCG2）[4]。因此闡明多藥耐藥基因的表達調(diào)控機制，控制多藥耐藥基因的表達將有助于逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥。

1 多藥耐藥基因MDR1的表達調(diào)控

MDR1是最早鑒定的多藥耐藥基因，其編碼的蛋白P-糖蛋白包含1 280個氨基酸，分子量170～180 kD。其在多種正常組織中表達，發(fā)揮轉(zhuǎn)運及分泌的功能，從而保護正常組織細胞免受細胞毒素及外源性有毒物質(zhì)的影響[5]。同時P-糖蛋白作為化療藥物的排出泵直接參與腫瘤細胞的多藥耐藥，其表達水平的高低直接與腫瘤耐藥相關。但MDR1的調(diào)控機制非常復雜，其在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平都受到多方面的調(diào)控。

1.1 MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

MDR1基因的啟動子區(qū)域含有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，能與多個轉(zhuǎn)錄因子及阻遏蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮正調(diào)控及負調(diào)控的作用[6]。轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-Y,NF-Y）能與MDR1啟動子區(qū)域的Y盒元件（反向CCAAT序列）結(jié)合，促進MDR1基因的轉(zhuǎn)錄。MDR1啟動子富含GC的區(qū)域GC盒能夠與轉(zhuǎn)錄因子SP1（specificity protein 1,SP1）結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄。而且這2個區(qū)域相鄰，NF-Y與SP1也存在直接的相互作用，兩者共同來調(diào)節(jié)MDR1的轉(zhuǎn)錄[7]。MDR1的啟動子區(qū)域含有2個轉(zhuǎn)錄因子AP1（activator protein 1,AP1）的結(jié)合位點，AP1可能通過與其他蛋白（如C-JUN、CFOS等調(diào)節(jié)因子相互作用），在不同的腫瘤耐藥細胞發(fā)揮促進或抑制轉(zhuǎn)錄的功能（例如在長春新堿耐藥的SGC7901胃癌細胞，轉(zhuǎn)錄因子AP1促進MDR1的轉(zhuǎn)錄增強耐藥，而在肺癌細胞H460及卵巢癌細胞SKOV3，過表達AP1則會抑制MDR1的轉(zhuǎn)錄[8]）。另外1個重要的MDR1轉(zhuǎn)錄因子是P53，野生型P53蛋白能負調(diào)控MDR1的表達，而突變型P53由于失去功能，表現(xiàn)出的則是激活作用[9]。NF-κB/P65和c-Fos形成復合體與啟動子區(qū)域的CAAT元件結(jié)合負調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[10]。除此之外，其他的一些調(diào)控MDR1的轉(zhuǎn)錄因子也被鑒定[如叉頭轉(zhuǎn)錄因子（fork head transcription factors,FOXO1）、增強子結(jié)合蛋白（CCAAT-enhancer binding proteins,C/EBP）和核因子NF-R1等]，他們分別可以結(jié)合啟動子區(qū)域的不同位點，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。除轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，MDR1的轉(zhuǎn)錄水平還被可以被一些誘導因素調(diào)節(jié)（如熱休克、X射線和一些化療藥物等[11]）。

MDR1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)非常復雜，因為啟動子區(qū)域有多個發(fā)揮調(diào)控作用的元件，而且很多元件相互重疊，因此不同的轉(zhuǎn)錄因子可能需要競爭性地發(fā)揮功能。同時一些轉(zhuǎn)錄因子又需要與其他蛋白相互作用，協(xié)同性地發(fā)揮調(diào)控作用。有研究表明，E2F1通過調(diào)控ATP結(jié)構(gòu)域運轉(zhuǎn)蛋白促進MDR1的啟動子活性，使P-糖蛋白的表達量增加，導致腫瘤多藥耐藥的發(fā)生[12]。透明質(zhì)酸（hyaluronan,HA）是大多數(shù)哺乳動物組織細胞外基質(zhì)的主要組成部分[13]。CD44是一種在多種正常細胞及腫瘤細胞和癌組織中表達的跨膜糖蛋白，有研究結(jié)果顯示在乳腺癌細胞中HA和CD44結(jié)合將刺激MDR1轉(zhuǎn)錄激活，進而導致腫瘤細胞耐藥發(fā)生[14]。

1.2 MDR1翻譯水平（P-糖蛋白）的調(diào)節(jié)

P-糖蛋白在翻譯及翻譯后水平也受到多種機制的調(diào)控，多條信號通路與P-糖蛋白的表達水平有關。而且P-糖蛋白功能的發(fā)揮還受到磷酸化、糖基化及泛素化等的調(diào)節(jié)。

研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases,MAPK）信號通路能夠正調(diào)節(jié)或者負調(diào)節(jié)P-糖蛋白的表達（包括ERK通路、p38 MAPK通路和JNK通路）；ERK信號通路參與多種細胞的生理功能（包括細胞增殖、分化和凋亡等）；抑制ERK信號通路能下調(diào)P-糖蛋白的表達；p38 MAPK信號通路在不同的腫瘤耐藥細胞發(fā)揮不同的作用，正調(diào)控或負調(diào)控P-糖蛋白的表達水平。5-氟尿嘧啶耐藥的肝癌細胞BEL-7402/5-FU，活化p38MAPK信號通路能減少MDR1的表達。而在長春新堿耐藥的胃癌細胞SGC7901/VCR，抑制p38MAPK能減少MDR1的表達[15]。

P-糖蛋白還是蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）和蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）磷酸化的底物，磷酸化對于P-糖蛋白自身的轉(zhuǎn)運和功能非常重要。P-糖蛋白多個絲氨酸位點可以被PKA和PKC磷酸化（如絲氨酸第661，667和671位點等）。PKA磷酸化MDR1促進其向細胞膜轉(zhuǎn)運，PKC活化能夠增加腫瘤耐藥細胞內(nèi)MDR1的磷酸化水平，從而減少藥物在細胞內(nèi)的積累[16-17]。

1.3 微小RNA調(diào)控MDR1的表達水平

微小RNA（micro RNAs,miRNA）是一種單鏈非編碼RNA，可以通過雜交互補的信使RNA調(diào)節(jié)基因的表達。很多研究表明，多種miRNA均能夠通過MDR1參與腫瘤耐藥（如miRNA-451、miRNA-27a、miRNA-145和miRNA-298等），能夠直接結(jié)合MDR1 mRNA的3'-UTR區(qū)域，抑制P-糖蛋白的表達，從而增加化療藥物的敏感性。而另外一些miRNA（如miRNA-137、miRNA-122和miRNA-138）能夠通過作用于其他蛋白，間接地減少MDR1的mRNA水平。相反有些miRNAs能促進MDR1的轉(zhuǎn)錄（如miRNA-19a/b的表達能夠增加MDR1 mRNA及蛋白水平），促進胃癌細胞阿霉素耐藥[18]。miRNA-503-5p的表達量增加后可使腫瘤細胞凋亡減少，MDR1的表達量增加，低表達miRNA-503-5p后腫瘤細胞對奧沙利鉑的敏感性增加，MDR1的表達量也隨之減少。還有研究表明，miRNA-21過表達將導致MDR1/P-糖蛋白的表達量增加，腫瘤細胞增殖增加。相反，降低miRNA-21將導致增殖相關的基因及MDR1/P-糖蛋白的表達量都會減少[19]。

總之，MDR1的表達水平直接與腫瘤細胞多藥耐藥相關，利用MDR1的抑制劑抑制其外排化療藥物的功能或者通過抑制相關信號通路從而調(diào)控MDR1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，對逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥有一定的效果。

2 細胞自噬與腫瘤細胞耐藥

細胞自噬是細胞發(fā)生的一種自我消化，是細胞在缺乏能量，饑餓，低氧，生長因子缺乏等各種壓力刺激下發(fā)生的一種促進細胞內(nèi)代謝廢物發(fā)生降解的一種反應，是真核細胞通過自我消化吞噬后維持生存的一種生物學行為。自噬的發(fā)生主要通過自噬相關基因、自噬相關蛋白、自噬相關細胞膜分子、自噬相關轉(zhuǎn)錄因子介導。自噬的發(fā)生和發(fā)展和多種疾病都有聯(lián)系，包括炎癥，腫瘤和耐藥[20]。

2.1 保護性自噬促進腫瘤細胞耐藥

自噬和腫瘤的關系極為密切，自噬可以通過不同的作用機制發(fā)揮不同的功能：一方面在正常細胞中自噬可以抑制正常細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞；另一方面在腫瘤細胞中自噬可以保護腫瘤細胞，當腫瘤細胞在饑餓缺氧等不利于存活的條件下就可以激活自噬獲得營養(yǎng)物質(zhì)和能力，促使腫瘤細胞抵抗化療藥物引起的凋亡等而長期存活。近年來越來越多的證據(jù)都表明自噬和耐藥基因的表達密切相關[21]。自噬可能是引起腫瘤細胞耐藥的一種新的重要機制[22]，研究證明自噬誘導腫瘤細胞耐藥的機制可能有兩種：腫瘤細胞可以利用溶酶體消化降解細胞內(nèi)的有功能障礙的細胞器及各種生物大分子，回收利用各種原料，使細胞免于凋亡和死亡，為細胞的生存提供重要保障；自噬是通過某種方式緩解細胞內(nèi)部壓力，降解有害物質(zhì)，使細胞能迅速適應新環(huán)境，保證細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及生存。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬導致腫瘤細胞耐藥主要依賴自噬信號通路及自噬相關基因的調(diào)節(jié)，目前其信號通路研究最多的是依賴mTOR的信號通路和非依賴mTOR的信號通路。mTOR信號通路是調(diào)節(jié)自噬的主要途徑，通常mTOR能抑制自噬的發(fā)生，mTOR主要是由mTORC1和mOTRC2兩種蛋白復合體形成，mTORC1是調(diào)節(jié)自噬的關鍵調(diào)節(jié)因子。主要通過PI3K/AKT/mTOR途徑發(fā)揮調(diào)控作用。進一步的研究表明，使用mTOR抑制劑Rapamycin可以阻斷mTOR信號通路來誘導自噬保護，導致腫瘤細胞發(fā)生耐藥[23]。自噬激活使細胞內(nèi)MDR1的表達量發(fā)生改變，在腫瘤細胞中Beclin1，LC3和MDR1的表達量成正比，在預后差的患者體內(nèi)也檢測到自噬水平的升高。YANG等[24]證明化療藥物-阿霉素和長春新堿可以通過Beclin1-Ⅲ類磷脂酰肌醇激酶3復合體（PI3K-Ⅲ/class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase,PI3KC3）的形成提高S100鈣結(jié)合蛋白A8的表達量。而S100A8通過調(diào)節(jié)自噬引起MDR1的表達量改變[25]。高遷移率族蛋白1（high-mobility group protein 1,HMGB1）也能通過從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)促進Beclin1-PI3 KC3復合體形成來誘導自噬，進而介導MDR1的表達使腫瘤細胞耐藥[26]。

miRNAs也能夠通過自噬調(diào)節(jié)MDR1的表達，XUE等證明在以順鉑為基礎的治療中，miRNA-199a-5p的表達量下調(diào)能夠激活自噬并使MDR1的表達量增加[27]；而在胃癌耐藥細胞SCG7901/DDP中，miRNA-181a能夠抑制自噬，提高腫瘤細胞對順鉑的毒性反應，使細胞凋亡增加[28]。因此自噬抑制劑的使用有助于增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。同樣，通過沉默自噬相關基因Beclin1、Atg5、Atg7及Atg12的表達降低自噬的發(fā)生可以有效控制腫瘤細胞耐藥。例如在7901/DDP細胞中通過過表達的miRNA-23b-3p可以調(diào)控Atg12和HMG2的表達增強耐藥腫瘤細胞對順鉑等化療藥的敏感性。而在7901細胞中通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNAs）靶定Atg12和HMGB2使腫瘤細胞自噬增強，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對化療藥產(chǎn)生耐藥性。在各種耐藥的腫瘤細胞中都可以檢測到MDR的表達增強，細胞可能通過發(fā)生保護性自噬并對化療藥物產(chǎn)生抵抗[29]；一方面，增強自噬能保護耐藥細胞減少凋亡的發(fā)生，增強腫瘤細胞的耐藥性；另一方面，抑制自噬可增強耐藥細胞對抗癌藥的敏感性。

2.2 過度自噬抑制腫瘤細胞耐藥

一些研究證實，自噬和腫瘤細胞化療耐藥密切相關，是腫瘤耐藥細胞的一部分。過度自噬在腫瘤耐藥中起著抑制的作用。該學說認為，細胞如果過度自噬會引起自噬性死亡，通過過度誘導自噬能有效殺死腫瘤耐藥細胞。通過自噬逆轉(zhuǎn)耐藥已經(jīng)成為研究癌細胞耐藥的另一個方面。異羥肟酸（SANA）是一種新開發(fā)的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，在乳腺癌耐藥細胞株中能誘導細胞發(fā)生自噬性死亡并能有效抑制腫瘤細胞生長[30]。隱丹參酮和二氫丹參酮是兩種脂溶性丹參酮，也能通過誘導自噬性死亡抑制結(jié)腸癌細胞增殖[31]。非衍生富勒烯C60團簇（nano-C60）在多種腫瘤細胞中都具有抗癌作用，nano-C60活化后能引起氧化應激誘導自噬發(fā)生，通過nano-C60誘導的自噬在乳腺癌細胞MCF-7中能提高化療藥物的敏感性[32]。本結(jié)果表明，自噬性死亡可以誘導耐藥細胞發(fā)生死亡，改善腫瘤細胞耐藥。盡管該分子機制到目前為止還不能確定，但該結(jié)果都表明自噬和耐藥的相關性。

綜上所述，自噬在腫瘤耐藥中能產(chǎn)生持久的作用，自噬促進細胞生存還是死亡依賴于腫瘤細胞的類型和不同的耐藥性。在一些耐藥的腫瘤細胞中可以檢測到凋亡基因表達量減少，而在該情況下適應性自噬可以增加耐藥細胞的耐藥性；但在某些特定情況下，過度的自噬可以清除一些抗凋亡信號通路，反而增加耐藥細胞對藥物化療的敏感性。通過調(diào)控MDR1的表達水平減少化療藥物的外排，以及利用腫瘤細胞自噬增加化療藥物的敏感性，將有可能為治療腫瘤耐藥帶來新的希望。