豬圓環病毒2型與豬鏈球菌混合感染的診治

楊年信，李幫林，向 輝，張惠明，楊克禮

（1.湖北省恩施土家族苗族自治州鶴峰縣畜牧獸醫局，湖北 鶴峰 445800；2.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，湖北 武漢 430064）

豬圓環病毒（Porcine cirovirus，PCV）是近年來危害我國養豬業發展的主要疫病之一，根據其基因組不同分為豬圓環病毒l型（Porcine cirovirus type l，PCV1）和豬圓環病毒2型（Porcine cirovirus type l，PCV2）[1]。PCV1對動物沒有致病作用，PCV2是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的主要病原。該病多以5～12周齡的仔豬發病率較高，主要臨床表現為呼吸困難、貧血、進行性消瘦、生長遲緩、偶有黃疽和腹瀉等[2-3]。

豬鏈球菌?。⊿.suis）是由鏈球菌引起豬的一種急性、敗血癥型和腦膜炎型的人畜共患傳染病[4]。按照莢膜多糖的差異，豬鏈球菌可分為35個血清型，引起豬和人發病的有1、2、9、7和8等血清型，以2型豬鏈球菌為主[5-6]。急性主要表現為敗血癥，一般未出現癥狀即死亡[7]，慢性主要表現為跛行、關節腫大或麻木，耳后、腹下、肛門周圍發紅，有出血點等[6]。哺乳仔豬發病主要以敗血癥型、腦膜炎型為主，發病率和死亡率均較高；肥育豬發病多以關節炎或淋巴結膿腫為特征，死亡率較低，但影響其生長發育[9]。

2017年3月，鶴峰某豬場的豬只先后大量發病，各階段的豬均有發病和死亡，持續近40 d，經濟損失較大。筆者將豬場送檢的病料送至湖北省農業科學院畜牧所重點實驗室進行病原分離鑒定和PCR檢測，診斷為PCV2和豬鏈球菌的混合感染。根據臨床及實驗室診斷結果，筆者提出了綜合防控技術方案，經實施后，疫情得到了有效控制。

1 材料與方法

1.1主要試劑M-肉湯培養基、營養瓊脂培養基、鮮血培養基以及其他生化培養基均購自青島高科技園海博生物技術有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker等，均購自TaKaRa公司；PCV2檢測引物由上海San-gon生物工程公司合成。

1.2樣品處理對無菌采取的病料組織直接涂到載玻片上，進行革蘭氏染色，無菌采集急性死亡病豬肺、脾及淋巴結等組織，制作抹片，經干燥、火焰固定后進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態特征。

1.3細菌分離培養于超凈工作臺中用接種環取肺、脾及淋巴結等病料直接接種于鮮血瓊脂平板，置37℃培養箱中培養24～48 h，挑取單菌落進行革蘭氏染色，符合豬鏈球菌的形態和溶血特征后，再挑取典型菌落接種于瓊脂斜面培養基、血清肉湯培養基和普通肉湯培養基，置37℃培養24～48 h，革蘭氏染色、鏡檢，并做進一步的生化試驗。

1.4病毒核酸的提取將病料組織與DMEM溶液按1:5混合，充分勻漿，-80℃至室溫反復凍融3次，立即提取核酸或置-80℃保存備用。病毒核酸的提取利用病毒DNA/RNA提取試劑盒按照說明書進行。

1.5 P C V 2 P C R擴增取提取的DNA，使用針對PCV2 ORF2基因設計的引物，進行PCR擴增。上游引物PCV2-F：5’-CGAGCTCATGACGTATCCAAGGAGGC-3’，下游引物PCV2-R：5’-CCCAAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGG-3’，產物預期大小約720 bp。PCR反應體系為25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mm）1 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 3 μL，Taq酶0.25 μL（5 U/μL），加滅菌超純水至25 μL；PCR反應參數如下：95℃變性5 min，按94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共進行30個循環，72℃延伸10 min。取5 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外觀測儀下觀察記錄結果。

1.6防控措施全場封群，全面消毒：在疫情期間，嚴禁生產區工作人員出入，飼養員和各類用具嚴禁串舍。出入豬場的車輛要進行嚴格消毒。舍外場地和豬舍空欄用2%～3%的燒堿溶液噴灑消毒。豬舍內每3 d用消毒水帶豬消毒1次，走廊和過道用福爾馬林液每3 d消毒1次。

緊急接種：對無明顯癥狀的豬只，分別緊急免疫自制苗2～4 mL。

對癥治療：對出現繼發感染的豬只，應用抗菌藥物進行治療，如環丙沙星、頭孢類藥物等；對呼吸困難的豬只使用止咳平喘藥物，如麻黃堿、氨茶堿等；對高熱豬只使用退燒藥物，如安乃近、氨基比林等。

輔助治療：豬圓環病毒為病毒性疫病，使用抗生素治療無效，只能對癥治療并控制繼發感染。建議配合使用病毒靈、干擾素、免疫球蛋白、高免血清等廣譜抗病毒的藥物進行輔助治療，同時可配合并使用甘草合劑、黃芪多糖等增強免疫力的藥物。

2 結果與分析

2.1臨床癥狀及剖檢病理變化臨床癥狀主要表現為發熱，食欲下降，呼吸困難、咳嗽，部分病豬皮膚發紅，部分病豬皮膚蒼白，部分母豬流產，部分仔豬有關節炎而出現運動障礙，后肢不能站立；個別豬突然發病，出現神經癥狀，仔豬和母豬均有死亡。剖檢病變主要表現為肺臟有大面積的出血、水腫，并有局灶性壞死結節，呈敗血癥的特殊癥狀；心臟外膜出血嚴重，腎表面有出血點，脾腫大，淋巴結腫大；關節腔內有黃色黏稠液體。

2.2細菌分離培養和鑒定結果鮮血瓊脂平板上可見灰白色表面光滑濕潤、稍微隆起的半透明的小菌落，菌落周圍可見約1 mm透明溶血環，呈典型的β-型溶血（圖1）；在普通瓊脂平板上菌落較小。在血清肉湯培養基中形成均勻渾濁，試管底部有明顯的沉淀，無菌膜。革蘭氏染色，鏡檢可見大量短鏈狀或長鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌（圖2）。對分離純化的細菌進行生化試驗，結果該菌發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、水楊酸和山梨醇，不發酵木糖、阿拉伯糖，綜上判定該菌為鏈球菌。

圖1 鮮血瓊脂平板上的菌落Fig.1 Colony on the blood AGAR plate

圖2 顯微鏡下的革蘭氏陽性鏈球菌Fig.2 The microphotograph of streptococcus suis

2.3 P C V 2 P C R檢測結果以病豬組織中提取的病毒DNA為模板，利用設計的PCV2特異性引物進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果所檢測的組織樣品全部擴增出與預期產物大小一致的目的條帶，即為PCV2陽性（圖3）。

圖3 PCV2 PCR擴增產物電泳圖Fig.3 The electrophoresis of the PCR product of PCV2

綜合以上結果可知，8份組織樣品檢測結果豬圓環病毒2型均為陽性，結合臨床表現及細菌分離培養結果，判定該豬場本次暴發的疫情為豬圓環病毒2型和豬鏈球菌的混合感染所致。

2.4防控效果采用上述綜合防控措施20 d后，該豬場的病情逐步得到控制，40 d后疫情平息，生產秩序恢復正常并逐步達到發病前的水平。

3 討論

根據實驗室分子生物學檢測結果，PCV2的陽性率為100%（8/8），結合臨床癥狀、剖檢病理變化及細菌分離培養結果，確診該豬場發生的疫病為PCV2與豬鏈球菌的混合感染。

PCV2可導致機體產生免疫抑制，使其抵抗力降低，容易引起其他病毒或細菌的繼發或并發感染，從而引起感染豬的大量死亡[10-11]。臨床上，PCV2的混合感染與其他病原體感染所引起的呼吸系統疫病的表現極為相似，并常伴隨其他混合感染或/和繼發感染。因此，僅根據流行病學、臨床癥狀以及剖檢變化很難對疫病作出正確診斷。PCR方法是當前的一種快速簡便、準確可靠的檢測方法，可用于臨床診斷。

由于PCV2是病毒性疫病，臨床上使用常規的方法控制其混合感染效果很不理想。本研究中使用自制苗進行防治，配合注射敏感抗生素、免疫增強劑液等，同時，采用加強飼養管理等綜合防控措施，取得了理想的防治效果。自制苗是在無菌條件下采集病豬的肺、脾、腎、淋巴結等組織經過甲醛滅活制成的，可用于發病場或發病地區PCV2的防治，但由于安全性等因素尚不能在生產中推廣應用。臨床使用時應先做安全性試驗，若有不良反應出現，需立即停止使用[12]。

豬鏈球菌病近年來發病率較高，對養豬業的影響較為嚴重。該病一年四季均有發生，飼養環境差、飼料營養失衡、應激等因素均可誘發本病[13]。但很多情況下，鏈球菌可繼發于其他病原感染之后，如PRRSV感染、PCV2感染等。因為PRRSV和PCV2均可以破壞豬的免疫系統，導致免疫抑制。已有的研究表明，PRRSV和PCV2病毒在豬體內可以相互促進增殖，混合感染具有明顯的協同致病作用[14]?；旌细腥臼沟秘i病情復雜化，給疾病的診治增加了難度，因此對發病豬盡早確診、盡早治療，以減少混合感染、繼發感染病例的發生。因此，加強對PCV2和PRRSV的預防，對豬場其他疫病的防控有著重要的意義。

無論是規?；B豬場，還是農村散養戶，對于疫病的防控均要貫徹“預防為主”的方針，加強飼養管理，搞好環境衛生。堅持自繁自養和全進全出的原則；同時保證豬群充足的營養，減少應激；豬舍保持良好的通風和適宜的溫度、濕度；定期消毒，交替使用消毒藥，防止耐藥菌株的產生。只有這樣才能最大限度地減少各類疫病的發生，避免不必要的經濟損失。

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