一例肉仔雞急性J亞群禽白血病暴發(fā)的診斷報(bào)告

楊國(guó)麗

（遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110164）

禽白血病病毒（avian leukemia virus，ALV）是引起家禽腫瘤性疾病的三種主要病原之一，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科正反轉(zhuǎn)錄病毒亞科α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員。ALV成員眾多，不同毒株間生物學(xué)特性存在差異。根據(jù)ALV在不同遺傳型雞胚成纖維細(xì)胞上的宿主范圍、囊膜糖蛋白抗原結(jié)構(gòu)和各個(gè)病毒亞群成員之間的干擾模式的差異，將ALV分為A-K共11個(gè)亞群，其中A、B、C、D、E、J和K 7個(gè)亞群[1-2]可感染雞。E亞群病毒是內(nèi)源性病毒，所謂的內(nèi)源性病毒是指能整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體并按著孟德爾遺傳規(guī)律垂直傳播給子代的ALV，內(nèi)源性ALV通常無(wú)致病性或致病性很弱；而A、B、C、D、J和K是外源性病毒，不能通過(guò)宿主細(xì)胞染色體傳播，致病力強(qiáng)，傳染性強(qiáng)。

獸醫(yī)臨床上所見到的AL多是由A、B、J亞群ALV引起的，近幾年來(lái)，我國(guó)學(xué)者又從我國(guó)獨(dú)有的一些地方品系雞中分離到了一個(gè)新的ALV亞群——K亞群白血病病毒。經(jīng)典的AL主要是A、B亞型病毒感染引起3月齡以上蛋用型雞發(fā)生經(jīng)典的淋巴細(xì)胞瘤，C、D亞群病毒感染引起的腫瘤在臨床上很難見到；E亞群病毒分布在除特殊培育的專門品系雞群之外的所有雞只中；J亞群主要引起髓樣細(xì)胞瘤，其致病性和傳染性均強(qiáng)于其他亞群，目前在我國(guó)已成為AL主要流行亞群，部分復(fù)制缺陷性并攜帶有腫瘤基因的J亞群病毒感染雞群后可引起急性型腫瘤的發(fā)生，已有關(guān)于30余日齡商品肉雞發(fā)生J亞群白血病的報(bào)道；K亞群病毒只在我國(guó)地方品種保種雞群中鑒定出來(lái)，致病性和傳染性相對(duì)低一些，K亞群的毒株在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)復(fù)制慢，p27抗原含量低，在進(jìn)行p27抗原檢測(cè)時(shí)容易漏檢，應(yīng)特別注意。水平和垂直傳播是AL傳播的特性，以垂直傳播為主，水平傳播在雛雞出殼時(shí)或在出雛箱內(nèi)是最為常見的。雞群感染ALV后導(dǎo)致感染雞發(fā)育緩慢、產(chǎn)蛋下降甚或發(fā)生血管瘤，病雞漸進(jìn)性消瘦，臨床表現(xiàn)為內(nèi)臟器官等組織器官發(fā)生惡性腫瘤等惡病質(zhì)，并且ALV感染會(huì)導(dǎo)致免疫抑制，ALV所造成的免疫抑制僅次于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。

ALV一般抵抗力不強(qiáng)，普通的消毒劑即可將其殺滅，且該病毒對(duì)熱較為敏感，高溫下極易滅活，但該病的防治依然面臨著巨大的困難[3]。現(xiàn)將一例16日齡肉仔雞發(fā)生急性J亞群AL病例的診斷情況報(bào)告如下。

1 基本情況

2017年3月13日，養(yǎng)殖戶從孵化場(chǎng)購(gòu)進(jìn)26 000只1日齡商品肉雞雛，采用“全進(jìn)全出”的籠養(yǎng)方式進(jìn)行飼養(yǎng)。從13日齡起雞雛陸續(xù)出現(xiàn)萎靡等癥狀，病雞主要表現(xiàn)為閉眼、呆立、縮頸、體型消瘦、雞冠蒼白和關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀，發(fā)病率約在2%左右，至4月5日就診前累計(jì)死淘500多只。該批次雞雛已按程序免疫新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎和法氏囊疫苗，聯(lián)合應(yīng)用抗病毒和抗細(xì)菌藥治療均無(wú)效。該養(yǎng)殖場(chǎng)周邊3個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)尚無(wú)疫病發(fā)生。

2 剖檢變化

剖檢可見病雞肩關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)有腫瘤結(jié)節(jié)，內(nèi)容物為灰白色滲出液，肝臟腫大暗紅，表面可見有針尖至粟粒大白色腫瘤結(jié)節(jié)，心肌和腸管有白色瘤狀物，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和剖檢的病理變化初步診斷為腫瘤性疾病，詳見圖1。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1細(xì)菌學(xué)檢測(cè)無(wú)菌采集病雞肝、心、脾和關(guān)節(jié)滲出液樣品分別接種于普通瓊脂、麥康凱瓊脂、血瓊脂、SS培養(yǎng)基和TCLS培養(yǎng)基于37℃溫箱培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h和48 h觀察結(jié)果，各培養(yǎng)基上均未見細(xì)菌生長(zhǎng)。樣品涂片，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢未見典型細(xì)菌。

3.2組織病理學(xué)檢測(cè)采集病雞肝臟、心肌和腸管病健交界部位進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，在10×80倍光鏡下觀察可見肝臟、心臟、腸管正常組織萎縮，髓樣細(xì)胞瘤發(fā)育階段一致，呈彌散性分布，由淋巴細(xì)胞形成血管套，并伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)性增生，詳見圖2。

3.3血清學(xué)檢測(cè)取送檢的15份雛雞血清進(jìn)行以下檢測(cè)。

3.3.1 AB亞群抗體ELISA檢測(cè) 用愛德土ALV AB亞群抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ELISA檢測(cè)15份血清，結(jié)果均為陰性。

3.3.2 J亞群抗體ELISA檢測(cè) 用愛德土ALV J亞群抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ELISA檢測(cè)15份血清，結(jié)果均為陽(yáng)性。

3.3.3 雞白痢平板凝集試驗(yàn) 用哈爾濱動(dòng)物生物制品國(guó)家工程研究中心有限公司的白痢平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)試劑進(jìn)行雞白痢抗體檢測(cè)15份血清，結(jié)果均為陰性。

3.4病原學(xué)檢測(cè)

3.4.1 ALV P27抗原ELISA檢測(cè) 用愛德土禽白血病抗原檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ELISA檢測(cè)肉雛雞15份血清

和15份泄殖腔棉拭子樣品，結(jié)果均為陽(yáng)性。

3.4.2 熒光RT-PCR檢測(cè) 被檢樣品：無(wú)菌采集病雞肝、心、脾和關(guān)節(jié)滲出液樣品混合成1份樣品，用禽白血病熒光RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性，詳見圖3。

3.4.3 普通RT-PCR檢測(cè) 引物片段由青島易邦生物工程有限公司提供。對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，被檢樣品同3.4.2。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，變性5 min；94℃30 s，56℃30 s；72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。結(jié)果AB亞群均為陰性；J亞

群AL為陽(yáng)性，條帶在800 bp左右，與預(yù)期大小相符，見圖4。

圖1 剖檢變化Fig.1 Autopsy change

圖2 組織病理學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果Fig.2 Histopathological microscope was used to observe the results

圖3 熒光RT-PCR陽(yáng)性曲線Fig.3 Fluorescence rt-pcr positive curve

圖4 電泳條帶圖Fig.4 Electrophoresis strips

綜上，從臨床癥狀、組織病理學(xué)檢查、血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)的結(jié)果，綜合診斷為此養(yǎng)殖戶發(fā)生的疫情由J亞群AL導(dǎo)致。

4 防治措施

疫病確診后，立即建議養(yǎng)殖戶淘汰掉雞群中所有的病弱雞，適當(dāng)提高舎溫，每天加強(qiáng)對(duì)雞群的巡視，連續(xù)7 d實(shí)行日消毒管理，雞群穩(wěn)定后改為每周消毒2～3次，并及時(shí)進(jìn)行新城疫和禽流感的加強(qiáng)免疫，在飲水中添加多維連續(xù)7 d，并全群投給抗菌藥物和提高免疫力的藥物5 d。采取這些措施后，雞群基本穩(wěn)定下來(lái)。由于采取及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)淘汰的措施，雞只因發(fā)生腫瘤而引起的的死亡得到控制，出欄時(shí)雞只成活率95%，但雞群采食量低、藥費(fèi)成本高，死淘率依然偏高，因本病繼發(fā)感染所致死淘率超過(guò)3%。出欄時(shí)平均體重2.1 kg左右，因本病造成的直接死亡率約在2%左右。

J亞群AL不僅造成一定死亡率，更能導(dǎo)致免疫抑制和繼發(fā)反應(yīng)，進(jìn)而嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能。急性致腫瘤性ALV病程短，給J亞群AL的防控提出了更大的難題，對(duì)該病的防控任重而道遠(yuǎn)。

5 小結(jié)與討論

對(duì)ALV的防控最根本的途徑是實(shí)現(xiàn)種源凈化，在國(guó)內(nèi)外有很多這樣的先例，這就要求種禽企業(yè)必須承擔(dān)起主體責(zé)任，與相關(guān)的技術(shù)技術(shù)部門大力協(xié)作，經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)世代的嚴(yán)格檢測(cè)淘汰，是可以實(shí)現(xiàn)種禽凈化的。進(jìn)行種禽凈化以防止ALV的垂直傳播和孵化出雛時(shí)的水平傳播。J亞群ALV是ALV家族中重要的成員之一，在外源性的ALV中，J亞群病毒致病性和傳染性都是最強(qiáng)的。自1987年J亞群AL被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其流行的范圍迅速擴(kuò)大，曾一度給世界肉雞飼養(yǎng)業(yè)造成慘重的損失。J亞群在我國(guó)發(fā)生過(guò)兩次大的流行，20世紀(jì)90年代后期，學(xué)者們?cè)谖覈?guó)發(fā)生ALV的肉種雞群中分離到該病毒，證實(shí)了J亞群AL已在我國(guó)流行，當(dāng)時(shí)肉用型雞群感染較為普遍，隨后各大肉雞育種公司加強(qiáng)了該病的凈化，很快使該病在肉雞中的流行得到了控制，但J亞群AL在我國(guó)的流行并沒(méi)有停止，J亞群ALV在選擇的壓力下，其基因組的變異速率加快，尤其是囊膜基因的突變，導(dǎo)致了病毒宿主范圍的擴(kuò)大，不僅擴(kuò)大到蛋雞，而且在我國(guó)的地方品種雞的感染也非常普遍。2008～2009年J亞群AL在我國(guó)蛋雞群中大暴發(fā)，每年大約有6 000萬(wàn)只蛋雞由于J亞群AL感染發(fā)病死亡或被淘汰，養(yǎng)殖者們損失慘重[4]，隨著凈化工作的有效展開，該病在蛋雞中的流行已被有效控制。根據(jù)ALV感染雞后誘發(fā)腫瘤病程的長(zhǎng)短，可將ALV分為兩類，即急性致瘤性ALV和慢性致瘤性ALV。急性致瘤性ALV其本身是復(fù)制缺陷性病毒，缺少基因組中g(shù)ag、pol和/或env基因的部分或全部，取而代之的是腫瘤基因。這類病毒感染雞后，在輔助病毒的協(xié)同下，經(jīng)2～3周就可誘發(fā)雞產(chǎn)生肉眼可見的腫瘤，而J亞群AL的部分毒株就是這類毒株，本案例是由急性致瘤性J亞群AL感染導(dǎo)致的急性AL。

在對(duì)AL進(jìn)行診斷或凈化時(shí)，單純的血清p27抗原檢測(cè)并不理想，假陽(yáng)性率高，無(wú)法區(qū)分內(nèi)源性和外源性病毒感染。需要對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果的樣本進(jìn)行測(cè)序或者是結(jié)合特異性的核酸探針作分子雜交檢測(cè)。最理想的診斷方法是采血進(jìn)行病毒的分離，這是對(duì)AL進(jìn)行診斷的“黃金”方法，但分離病毒時(shí)操作程序繁瑣、需要在專門的實(shí)驗(yàn)室由經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員來(lái)操作細(xì)胞系，技術(shù)性強(qiáng)，并且歷時(shí)較長(zhǎng)。大量的實(shí)踐表明，檢測(cè)種蛋蛋清和初生雛雞胎糞p27抗原與病毒分離方法的吻合性高；另外在雛雞出殼后的36～48 h，雛雞血清中ALV抗體與其親代的抗體水平有很高的平行性，可采用適時(shí)檢測(cè)雛雞抗體的方法來(lái)初步判定雛雞是否有垂直傳播感染ALV的可能性。在本案例中，由于其他原因沒(méi)有獲得該批商品肉雞親代的種蛋，也沒(méi)能采集到初生雛雞的胎糞，這是一個(gè)遺憾。

ALV感染雞群導(dǎo)致免疫抑制作用僅次于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。在進(jìn)行腫瘤的病例組織學(xué)檢查時(shí)，禽白血病的腫瘤細(xì)胞在顯微鏡下觀察，盡管細(xì)胞形態(tài)上有差異，但腫瘤細(xì)胞的發(fā)育階段是一致的，這是AL與雞馬立克病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染誘發(fā)腫瘤的主要區(qū)別。本案例中，在顯微鏡下可見髓樣細(xì)胞瘤都處于原始發(fā)育階段。結(jié)合流行病學(xué)、剖檢變化、血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)，最終診斷為本次疫情是由J亞群禽白血病感染所誘發(fā)的急性腫瘤。

[1]QIU Y,LI X,FU L,et al.Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup A avian leucosis virus[J].Veterinary and Comparative Oncology,2014(1):47-51.

[2]顧玉芳，多婷，楊玉瑩，等.ALV-J HB2009株誘發(fā)雞白血病的致病性研究[J].中國(guó)家禽，2012（20）：52-54.

[3]葉建強(qiáng)，秦愛建，邵紅霞，等.J亞型ALV（ALV-J）ELISA檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006（3）：235-237.

[4]崔治中.禽白血病及其防控百問(wèn)百答[J].中國(guó)家禽，2016，38（23）：72-74.