中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合癥病原及病理學研究

楊宗英 張一柳 胡 鯤 劉力碩 蔡紅桂 張鳳翔 楊先樂

(1. 上海海洋大學國家水生動物病原庫, 上海 201306; 2. 南昌市農業科學院, 南昌 330038;3. 興化市安豐鎮水產站, 興化 225766; 4. 興化市漁業技術指導站, 興化 225700)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又稱河蟹、毛蟹、清水蟹、大閘蟹, 因其味道鮮美而深受人們喜愛。我國的中華絨螯蟹養殖模式在不斷地改善和發展, 養殖產量也在逐年上升, 但是隨著我國養蟹產業的蓬勃發展, 集約化程度不斷提高, 中華絨螯蟹的病害問題也顯得尤為突出。江蘇省是中國中華絨螯蟹養殖大省, 興化市則被授予“河蟹養殖第一縣”的稱號, 中華絨螯蟹養殖業成為了當地的支柱產業。然而, 2015年大面積暴發的中華絨螯蟹“水癟子”病對興化的中華絨螯蟹養殖業造成了沉重的打擊, 尤其7月中旬“燦鴻”臺風過境后, 江蘇省興化市80%以上的塘口出現了該病[1], 蟹農損失慘重。中華絨螯蟹“水癟子”病已引起了各級政府和廣大蟹農的關注。

本文首次對采自中華絨螯蟹“水癟子”病流行區的病蟹進行病原學和病理學的系統研究, 旨在為中華絨螯蟹“水癟子”病發病原因的確定及診斷提供科學參考, 也為在養殖過程中對該病的防控提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗用患病中華絨螯蟹采自江蘇省興化市安豐鎮發病養殖塘, 100只, 規格為80—100 g, 健康蟹采自江蘇省張家港市中華絨螯蟹養殖基地, 規格100—120 g, 采樣時間均為2016年9月份。病蟹肝胰腺淡黃色或土黃色, 鰓絲水腫或稍發黑, 附肢發軟、附肢肌肉萎縮; 健康蟹肝胰腺呈橘紅色, 肌肉飽滿。

1.2 病原學檢測

寄生蟲檢測將30只病蟹體表、肝胰腺、鰓、肌肉等組織制成水浸片, 參照《水生動物寄生蟲學》[2], 對病蟹進行寄生蟲檢查。

細菌學檢測取30只病蟹, 用無菌水沖洗干凈后, 75%酒精棉球反復擦拭病蟹的步足外表及外殼, 進行初步的蟹體消毒, 用滅菌注射器從病蟹的第三步足基部抽取血淋巴, 迅速將1滴血淋巴滴到普通營養瓊脂上作劃線分離, 同時取肝胰腺、鰓、腹水、肌肉等組織于普通營養瓊脂上作劃線分離,28℃培養24h, 待平板上長出形態一致的優勢菌落后, 挑選單菌落再次進行劃線分離, 獲得純培養物后接種于斜面培養基上保存。菌種的鑒定參考周德慶[3]和Bachanan等[4]的方法。

將分離純化的菌株在新鮮斜面培養基上于28℃培養24h, 分別用無菌生理鹽水洗下制成菌懸液, 用麥氏比濁管比濁和血球計數板計數后, 將菌液濃度稀釋為1×108CFU/mL。選擇取自張家港市中華絨螯蟹養殖基地健康無病, 附肢健全的中華絨螯蟹, 在90 L水族箱中進行分組飼養2周, 待死亡率低于5%且穩定時, 將分離純化的菌懸液從健康中華絨螯蟹第三步足基部注入體腔(0.2 mL/只)進行攻毒試驗, 其中每株菌的攻毒試驗組設置3個重復,每個重復放入健康中華絨螯蟹30只, 對照組注射等量無菌生理鹽水。將不同菌株感染的中華絨螯蟹試驗組和對照組置于不同持續充氧的水族箱中, 飼養3個月并觀察試驗蟹是否發病, 水溫25—28℃, 水體pH7.10—7.25, 溶解氧6.45—6.75 mg/L。試驗期間每天正常投喂一次中華絨螯蟹全價配合飼料, 每天換水1/2。

病毒學檢驗取10只病蟹的病變組織, 加入等體積生理鹽水勻漿, 10000 r/min離心20min, 上清液用孔徑0.22 μm的濾膜過濾, 濾液經營養瓊脂28℃培養24h, 確保無菌后作為病蟹組織的無菌組織濾液備用[5]。取一份濾液于30只健康中華絨螯蟹的第三步足基部注射(0.2 mL/只), 對照組每只蟹注射等量的滅菌生理鹽水, 同樣置于充氧的水族箱中進行養殖觀察, 另取少許濾液滴在有支持膜的銅網上, 幾分鐘后用干凈濾紙從網邊吸去多余的液體,待濾液稍干后, 用2%磷鎢酸液染色1min, 濾紙吸去染液后, 在日立H60透射電鏡下觀察[6]。

同時取病蟹的肝胰腺等病變組織, 用2.5%戊二醛溶液前固定, 1%鋨酸后固定, 固定樣品經酒精、丙酮脫水, Epon 812樹脂包埋, 制備超薄切片, 透射電鏡觀察, 檢查病變組織內可能存在的病毒顆粒及包涵體[7]。

1.3 組織切片的制備

選取30只病蟹和正常蟹的肝胰腺、鰓、附肢肌肉等組織, Bouin氏液固定, 固定樣品經70%、80%、95%、100%梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 常規石蠟包埋。使用手搖式切片機切片(厚度約5 μm),H.E(蘇木精-伊紅)染色, Olympus顯微鏡觀察、拍片[8]。

2 結果

2.1 病癥

發病初期, 病蟹攝食量減少或者完全停止攝食、食線不飽滿, 活動能力弱, 附肢無力, 反應遲鈍,有些病蟹還伴有磨爪。后期可見病蟹殼發黑, 和正常的青殼有很大的差別, 底盤比較臟, 附肢中空, 用手輕按即會下陷。

將健康蟹和病蟹分別腹部向上放置, 健康蟹可以迅速翻身, 病蟹翻身艱難且速度較慢甚至無法翻身。解剖30只病蟹, 初期可發現病蟹鰓絲腫大, 肝胰腺腫脹并伴有將腫脹的肝胰腺排出體外的傾向,所占比例為33.33%, 嚴重時可見鰓絲呈灰白色或者黑色并且脆, 甲殼內有大量積液, 打開甲殼過一段時間, 積液可以形成果凍狀, 肝胰腺由橘黃色變成淡黃色、土黃色或者白色并伴有鰓絲水腫、肌肉萎縮, 所占比例為50.00%, 隨著病情加重, 病蟹的肝胰腺糜爛呈漿糊化, 并且具有黑鰓、灰鰓, 胸腔積水及個別病蟹排泄肝胰腺等癥狀, 蟹體有強烈的異味, 所占比例為16.67%。

2.2 病原生物檢測結果

寄生蟲檢測結果病蟹體表和體內很少有寄生蟲寄生, 在患病嚴重的蟹體偶爾發現有累枝蟲、鐘形蟲, 30只病蟹中, 有4只蟹檢出有寄生蟲寄生, 所占比例為13.33%, 其中2只蟹檢出鐘形蟲, 2只蟹檢出累枝蟲, 數量很少, 這些少量的纖毛蟲不足以引起中華絨螯蟹發病, 且在部分健康蟹的甲殼或鰓上同樣能夠檢測出幾個纖毛蟲類寄生蟲, 30只健康蟹中, 有5只檢出有寄生蟲寄生, 所占比例為16.67%, 其中3只檢測出有少量的鐘形蟲, 2只檢測出有少量的聚縮蟲, 其他寄生蟲未檢出。

細菌學檢測結果病蟹體內分離到的優勢菌有5株, 分別是S077-1、S077-2、S077-3 、S077-4 、S077-5, 參照周德慶[3]和Bachanan等[4]的研究結果, 經鑒定有3株菌屬于弧菌屬(Vibriosp.), 在30只病蟹中出現的頻率分別是16.67%、23.33%和10.00%, 1株菌屬于希瓦氏菌屬(Shewanellasp.)出現頻率為20.00%, 1株菌屬于不動桿菌屬(Acinetobactersp.), 出現頻率為10.00%, 細菌回感試驗, 感染組和對照組中華絨螯蟹在養殖3個月內均未出現任何病癥。

病毒學檢測結果病蟹組織除菌上清液接種健康蟹, 接種蟹在養殖3個月內未見中華絨螯蟹出現“水癟子”病樣癥狀, 負染電鏡觀察也未見除菌上清液中有病毒顆粒存在, 且電鏡觀察病蟹組織也未見明顯的病毒顆粒和包涵體。

2.3 正常中華絨螯蟹的組織學觀察及病蟹組織病理變化

正常中華絨螯蟹肝胰腺的組織學觀察和病蟹肝胰腺組織病理變化同十足目的其他種類相似, 正常中華絨螯蟹的肝胰腺由無數肝小管組成,肝小管是肝胰腺的結構和功能的基本單位, 肝小管的中央是管腔。每一肝小管都是由位于基膜上的單層柱狀上皮細胞構成, 細胞核排列整齊, 細胞間界線清楚, 上皮細胞分為胚細胞(EC)、分泌細胞(BC)、吸收細胞(FC)和儲存細胞(RC)(圖版Ⅰ-1)。中華絨螯蟹在發病初期肝胰腺為淡黃色, 肝細胞大部分水腫、變性, 出現少量的轉運泡和空泡, 細胞排列輕度紊亂(圖版Ⅰ-2), 隨著病情的發展, 肝小管柱狀上皮細胞腫大加劇, 部分細胞間界線消失, 細胞出現融合, 空泡數量增多且體積增大(圖版Ⅰ-3);轉運泡體積增大且轉運泡內的顆粒物增多(圖版Ⅰ-4); 基膜部分破裂, 且有部分肝細胞壞死, 可見壞死物落入管腔中(圖版Ⅰ-5); 基膜與柱狀上皮細胞完全分離, 肝細胞結構模糊, 部分細胞解體, 散落在管腔中(圖版Ⅰ-6); 基膜與上皮細胞完全分離, 且基膜破裂, 部分細胞核碎裂或崩解, 內容物外流(圖版Ⅰ-7); 肝小管結構消失, 僅見模糊的肝小管輪廓, 肝胰腺外觀呈漿糊狀(圖版Ⅰ-8)

正常中華絨螯蟹鰓的組織學觀察和病蟹鰓病理變化正常中華絨螯蟹每條鰓都由具有支撐和運輸功能的鰓軸及向兩側發出的相互平行的鰓葉構成, 正常鰓葉由外向內分別是角質膜, 上皮細胞層和鰓腔, 其中網狀的鰓腔由上皮細胞和柱狀細胞共同形成, 鰓腔中有曲折迂回的通道, 有少量游離的血細胞(圖版Ⅱ-1、2)。患病中華絨螯蟹鰓葉增厚, 上皮層破壞, 角質膜呈波狀拱起, 甚至斷裂,上皮細胞排列不規則, 上皮細胞層出現空泡; 鰓腔擴大, 鰓腔中血細胞增多(圖版Ⅱ-3、4)。

正常中華絨螯蟹肌肉的組織學觀察和病蟹肌肉病理變化中華絨螯蟹的附肢肌肉為橫紋肌,肌纖維排列整齊, 橫紋清晰, 細胞核呈梭形或圓形,位于細胞邊緣(圖版Ⅱ-5), 患病中華絨螯蟹, 纖維松散, 部分肌纖維輕度變性或橫紋消失(圖版Ⅱ-6)。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹“水癟子”病的發病特征和流行情況

根據已做調查匯總[9], 中華絨螯蟹“水癟子”病主要在江蘇省中華絨螯蟹主養區興化發生, 并且是在2015—2016年才大面積暴發的疾病。據文獻[10]記載, 該病的發生至少有7年之久, 之前的發病率較低, 并未引起人們的廣泛關注, 2015年該病的大面積暴發給興化的中華絨螯蟹養殖業造成了沉重的打擊, 經濟損失達10億多元[1]。該病在3—4月份就開始大量出現, 在5—8月份上旬是該病的高發期,死亡率較高, 在高溫期過后, 死亡率逐漸下降直至達到平穩甚至恢復的狀態。該病在仔蟹期、扣蟹期和成蟹期均存在, 對于仔蟹和扣蟹, 該病的危害主要是導致肝胰腺變成淡黃色或土黃色, 對于成蟹,往往還會導致成蟹脫殼不遂或脫殼后很難鈣化, 甲殼薄且脆。

3.2 中華絨螯蟹的病理特點

解剖病蟹可見病蟹的肝胰腺大多呈現水腫、萎縮、糜爛的狀態; 頭胸甲內有積液, 積液呈果凍狀; 鰓絲水腫或伴有灰鰓、黑鰓; 附肢發軟, 剪開附肢可見肌肉萎縮且有水狀液體流出。病變組織石蠟切片觀察結果顯示, 病變最嚴重的器官是肝胰腺,病情較輕的中華絨螯蟹, 肝胰腺的肝細胞水腫、空泡樣變性、排列紊亂。肝胰腺呈漿糊狀壞死的, 病理切片顯示, 肝小管萎縮甚至結構消失, 細胞核崩解。鰓組織相對肝胰腺病變較輕, 主要癥狀為鰓葉增厚, 鰓組織中出現細胞濁腫, 鰓葉上皮細胞及柱狀細胞廣泛變性, 排列不規則, 角質膜呈破浪狀拱起, 部分區域出現細胞壞死, 鰓腔擴張, 鰓腔中血細胞增多, 上皮細胞層出現空泡; 肌肉組織病變相對來說最輕, 主要表現為肌纖維松弛, 部分肌纖維變性或橫紋消失。

依據本病的初步研究結果可推測中華絨螯蟹“水癟子”病, 是一種嚴重的器官損害性疾病, 肝胰腺是主要的靶器官且病變最嚴重。肝胰腺是甲殼類動物重要的消化免疫器官, 其消化酶活力遠超過腸道和胃[11], 同時甲殼動物肝胰腺的也與物質的貯存、排泄和蛻皮周期有關[12], 其重要的功能之一就是對毒物的分解作用, 大部分進入中華絨螯蟹體內的毒物都要肝胰腺分解為無毒物質。患“水癟子”病的中華絨螯蟹, 肝胰腺發生嚴重的病理變化, 且局部發生壞死, 使中華絨螯蟹的肝胰腺功能受到嚴重損傷, 再加上中華絨螯蟹鰓組織細胞發生變性、壞死, 會直接影響到中華絨螯蟹的氣體交換[13,14]。此時會發現中華絨螯蟹食欲下降或者不吃食, 由于攝食量減少或停止攝食, 長期的能量供應缺乏會對中華絨螯蟹本身的正常生理活動造成不可挽回的影響[15]。病蟹出現活動緩慢, 上草或上岸不回, 活力下降, 大螯握力減少等癥狀。這也導致了病蟹免疫力下降, 更容易受到外界環境的影響, 出現死亡。

目前對中華絨螯蟹“水癟子”病的診斷主要根據其臨床癥狀——肝胰腺萎縮壞死。但僅僅憑借這些發病癥狀來診斷中華絨螯蟹的“水癟子”病, 嚴格來說是不準確的。因為中華絨螯蟹生活的水環境復雜, 水體理化因子的突變或持續性毒害以及水體中存在的多樣性病原都可能使中華絨螯蟹發生病變, 并且中華絨螯蟹的許多疾病均可能出現相似的癥狀。本文在患“水癟子”病中華絨螯蟹組織器官中觀察到的病理變化, 如肝細胞空泡化、肝細胞壞死, 鰓葉腫脹, 細胞核破裂等是中華絨螯蟹“水癟子”病的一個重要特征, 根據這些特征可以準確診斷中華絨螯蟹“水癟子”病。

3.3 發病原因

在對中華絨螯蟹“顫抖病”研究中, 通過電子顯微鏡觀察可在中華絨螯蟹病變組織內發現病毒顆粒[13]、螺原體[16]和類立克次氏體[17]等病原生物, 電鏡觀察患“水癟子”病蟹的病變組織和病變組織上清液時, 未見病毒顆粒等病原生物, 且無菌濾液回感也未出現任何癥狀; 寄生蟲學檢測極少見蟹體有纖毛蟲寄生; 在肝細胞壞死的肝組織和鰓中分離、純化出5株優勢菌, 但是回感試驗證實5株菌并非中華絨螯蟹“水癟子”病的致病菌, 并且研究發現隨著病蟹病情的加重, 感染細菌的量越多, 由此確定壞死細胞及組織中出現的細菌是由于病蟹免疫力下降而導致的繼發感染。除此之外, 之前對中華絨螯蟹“水癟子”病的發病情況[9]進行調查時發現, 在養殖方式上, 養殖密度越高的發病率往往越高; 用菊酯、敵百蟲等高毒農藥清塘的發病率明顯比用生石灰、茶籽粕等無毒、低殘留的高; 同一養殖戶不同塘口飼養的不同苗種發病率也有不同, 但是并沒有顯示出對品種顯著的依賴性; 中華絨螯蟹養殖戶在治療中華絨螯蟹“水癟子”病方面, 無論是用殺蟲藥(對纖毛蟲類有效的藥), 殺菌、抑菌藥物(抗生素類)還是抗病毒藥物(嗎啉呱等)均無效。由此判斷,生物性病原并不是引發中華絨螯蟹“水癟子”病的關鍵因子。

患“水癟子”病的病蟹其主要的病變組織為肝胰腺和鰓, 其病理變化與斑節對蝦(Penaeus monodon)[18]和小龍蝦(Orconectes propinquus)受到異物[19]或異常環境因子[20]脅迫, 中華絨螯蟹受到藥害脅迫[21]、高氨氮脅迫[22]和飼喂含組織胺的飼料[23], 中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)受到高pH脅迫[24], 三疣梭子蟹在低鹽脅迫[25]時表現出來的病理特征相似, 都是肝細胞的空泡樣變性、出現轉運泡、壞死和鰓葉增厚、上皮細胞變性、鰓角質膜拱起, 局部空泡化, 鰓腔中血細胞增多。有研究表明, 甲殼動物在環境脅迫條件下, 會將自身儲存的營養物質主要用于維持機體的基本生理代謝[26], 當脅迫因子超過肝胰腺的解毒能力時, 肝胰腺的正常結構和生理功能將被破壞,肝細胞內空泡和轉運泡數量增多, 體積增大。有研究推測B細胞及其內部轉運泡數量增多, 體積增大有助于肝胰腺對營養物質的代謝吸收[27]。還有研究表明轉運泡內的顆粒物質和空泡中包裹的物質是脅迫機體的一些異物, 轉運泡和空泡能夠將之排出體外, 起到解毒的目的[21,22]。Rabin[28]認為甲殼動物血細胞的功能主要有凝固、吞噬和合成糖原的功能, 患病中華絨螯蟹鰓腔中血細胞增多, 應該是血細胞通過對異物的吞噬作用或者釋放能量以供鰓細胞利用, 是機體的一種自我防御體現[29—31]。比較這些病變特征, 可以得出中華絨螯蟹是由于受到了一些毒害因子的脅迫, 所以呈現出了“水癟子”病樣的癥狀, 但是究竟是哪些有害因子導致中華絨螯蟹患“水癟子”病, 還需要進行進一步的研究。

3.4 致病機理

甲殼動物的體色的主要取決于類胡蘿卜素的含量, 中華絨螯蟹缺乏相關的酶系, 所需類胡蘿卜素必須從食物中獲得。蝦青素是體表色素中主要的類胡蘿卜素, 蝦青素本身呈現紅色, 在與蛋白質結合后生產藍色蝦青素蛋白沉積于甲殼動物體表[32]。與蝦青素不同, β-胡蘿卜素主要儲存在甲殼動物的脂肪組織中, 其本身的顏色因濃度的差異, 可涵蓋由橘紅至黃色的所有色系, 在肝胰腺中, β-胡蘿卜素所占的比例高達42%—90%[33], 正因為β-胡蘿卜素的含量不同, 致使甲殼動物的肝胰腺也呈現不同程度的黃色。蝦青素和β-胡蘿卜素是甲殼動物防御系統中非酶促系統的重要成員, 其中蝦青素的單線態氧淬滅能力是α-生育酚的100倍[34], β-胡蘿卜素是α-生育酚的50倍[35,36], 毒害因子脅迫往往會導致產生大量的活性氧自由基, 對中華絨螯蟹造成氧化脅迫[37], 在中華絨螯蟹受到毒害因子脅迫時, 蝦青素和β-類胡蘿卜素很可能最先被動用清除體內的活性氧自由基, 從而引起類胡蘿卜素的含量減少,出現了“水癟子”病蟹體色變黑和肝胰腺顏色退色變白的癥狀[38]。還有一點就是類胡蘿卜素是脂溶性的, 不飽和脂肪酸的含量越高越有利于類胡蘿卜素的吸收和沉積[39], 脅迫因子可以引起中華絨螯蟹脂質過氧化, 使細胞膜脂肪酸的不飽和度降低, 吸收和沉積類胡蘿卜素的能力也隨之降低[40]。

肝胰腺不僅是甲殼動物動物重要的消化器官,同時也是重要的解毒器官, 其組織結構的可在一定程度上反映生物體受脅迫的程度[41]。甲殼動物在受到脅迫時會將自身儲存的營養物質主要用于維持機體的基本生理代謝[26], 肝胰腺病變發白, 肝細胞空泡化將進一步造成肝胰腺代謝異常, 對營養物質的消化吸收能力降低, 從而導致全身性功能障礙,免疫機能下降, 同時繼發細菌感染會導致中華絨螯蟹的黑鰓、灰鰓等癥狀。甲殼動物的血細胞除有重要的免疫防御功能之外, 也和呼吸有關[42], 鰓腔中血淋巴減少和血細胞凝集會嚴重影響中華絨螯蟹鰓的呼吸功能, 因此“水癟子”病蟹容易缺氧, 上草、上邊不回。“水癟子”病蟹整體免疫機能的下降也使病蟹對外界環境的變化極為敏感, 在環境出現驟變或長途運輸時很容易出現死亡。

3.5 中華絨螯蟹“水癟子”病的科學定名

中華絨螯蟹“水癟子”病是當地養殖戶的俗稱,因為病蟹大多黃和肌肉不飽滿, 有的甚至無黃, 且頭胸甲內有積液, 剪斷附肢也有水狀液體流出, 為此養殖戶形象地稱之為“水癟子”。從組織學和解剖學上來說, 蟹黃就是中華絨螯蟹的肝胰腺, 因此養殖戶所說的無黃也就是中華絨螯蟹的肝胰腺不飽滿, 健康中華絨螯蟹的肝胰腺呈橘黃色, 病蟹的肝胰腺顏色變淡, 且隨著病情發展, 出現萎縮壞死。目前, 對于水產動物病害的研究, 存在一病多癥, 一癥多病、同名異病和同病異名等問題, 給科研工作者帶來很大的困難, 本文研究初步表明中華絨螯蟹“水癟子”病為非生物性疾病, 根據病因和病癥給予中華絨螯蟹“水癟子”病科學的定名, 即中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合癥(Hepatopancreatic necrosis syndrome, HPNS)。

圖版Ⅰ 對照組和患病中華絨螯蟹肝胰腺組織病理觀察PlateⅠ The histology of hepatopancreas of control group and disease Chinese mitten crab

圖版Ⅱ 對照組和患病中華絨螯蟹腮和肌肉組織病理觀察PlateⅡ The histology of gill tissue and limbs muscle of control group and disease Chinese mitten crab

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