青海湖裸鯉舌狀絳蟲裂頭蚴的分子鑒定及系統發育研究

張學勇 簡瑩娜 李秀萍 裴全邦 王戈平王光華 蔡其剛 馬利青

(1. 青海大學畜牧獸醫科學院, 省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室, 西寧 810016;2. 青海省畜牧獸醫科學院, 西寧 810016; 3. 青海省三角城種羊場, 剛察 812300)

青海湖(Qinghai Lake)位于我國青藏高原東北部、青海省境內, 是我國最大的內陸咸水湖。該湖孕育的青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)是湖中唯一特有魚類, 又名青海湖湟魚, 不僅是青海湖及其支流的重要高原特色耐低溫鹽堿性經濟魚類,還是《中國物種紅色名錄》收錄特色珍稀保護物種[1,2]。腸舌狀絳蟲裂頭蚴(Ligula intestinalispleroceroid)是引起魚類寄生蟲病的一種絳蟲幼蟲, 其成蟲寄生于水鳥的腸道中, 由水鳥排出帶蟲卵的糞便到水中并孵化為鉤蚴, 鉤蚴被水蚤吞食后在其體內發育為原尾蚴, 帶原尾蚴的水蚤被魚類吞食后發育為裂頭蚴, 感染裂頭蚴的魚被水鳥捕食后在其腸內發育成成蟲并產卵, 就此完成寄生生活史[3]。腸舌狀絳蟲裂頭蚴在青海湖裸鯉體內可生長發育, 且生長可達數十厘米甚至幾米, 嚴重擠壓裸鯉體內器官迫使其萎縮, 特別是對魚性腺的發育造成巨大影響[4], 嚴重時導致裸鯉死亡, 是裸鯉養殖及漁業資源保護的大敵[3—5]。感染有腸舌狀絳蟲裂頭蚴的裸鯉被水鳥水禽等吞食后, 裂頭蚴可在腸中發育為成蟲,成蟲對鳥類的健康可能同樣會造成影響。

形態學鑒定是經典的傳統的分類鑒定方法, 但是對于形態特征簡單, 或者幼蟲相似的鑒定存在局限性, 這就需要用分子生物學方法對寄生蟲進行輔助分類鑒定。其中, PCR擴增及DNA序列多態性同源性分析是更有效的方法之一[6]。Bouzid等[5]選用COⅠ和COB基因進行遺傳分子進化研究, 發現不同地區的L. intestinalis及其宿主特異性是L. intestinalis發生生殖隔離及種系進化的重要力量, 鳥類的遷徙可能使種系同質, 打破了生殖隔離的遺傳障礙。本研究利用舌狀絳蟲核基因18S rRNA基因和線粒體基因COⅠ和COB基因進行裸鯉舌狀絳蟲裂頭蚴分子鑒定, 并基于這3個基因的聯合分析對舌狀絳蟲裂頭蚴分離株分子進化發育進行研究。

1 材料與方法

1.1 樣品獲取及基因組DNA的提取

當地獸醫從死亡的青海湖裸鯉體內發現“面條樣”寄生蟲: 蟲體呈現乳白色, 扁平長帶狀不分節,長約40 cm(圖1)。剪取0.5 cm3大小的組織塊分別放入新的保存管中, 用剪刀剪碎組織, 利用天根DNA提取試劑盒提取DNA, 具體操作步驟按照試劑盒使用說明書進行, DNA置于-20℃長期保存。

圖1 “面條樣”蟲體標本Fig. 1 The specimen of noodle-like parasite

1.2 PCR分子鑒定

利用Primer3 Input (version 0.4.0)軟件, 基于GenBank基因組數據庫18S rRNA基因和COⅠ和COB基因設計引物進行PCR分子生物學鑒定。所用引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表 1)。PCR擴增酶為寶生物工程(大連)有限公司的PremixTaq酶, 擴增反應體系如下: PremixTaq25.0 μL,上下游引物(濃度10 μmol/L)各2 μL, 模板DNA 3 μL,補充水18 μL至PCR反應體系為50 μL。擴增后PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳(電壓120 V, 時間30min), 電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結果并拍照。

表 1 舌狀絳蟲PCR分子生物學鑒定所用引物Tab. 1 Primers used for identification of Ligula intestinalis

1.3 基因測序分析

PCR陽性產物測序委托北京金唯智生物科技有限公司完成, 采用Sanger雙脫氧鏈終止法進行雙向測序。測序結果經峰圖分析后, 在GenBank上用采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法進行同源序列搜索, 應用MEGA 5.0軟件和Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在線軟件進行分析核苷酸序列和氨基酸序列的同源性。

1.4 序列比對與構建系統發育樹

通過NCBI提供的BLAST在線搜索服務軟件獲取其他舌狀絳蟲的18S rRNA基因和COⅠ和COB基因序列。使用MEGA 5.0軟件的系統發育樹構建功能對這些基因序列進行分析, 選擇鄰近法(Neighbor-Joining method, NJ)構建系統發育樹, 并使用自展值(Bootstrap)檢驗其可靠性, 重復次數為2000, 分析不同分離株絳蟲間的進化關系。

2 結果

2.1 PCR分子鑒定

利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA后, 基于18S rRNA基因進行PCR擴增, 擴增出約569 bp的目的片段; 基于COⅠ基因進行PCR擴增鑒定, 擴增出396 bp的目的片段; 同樣基于COB基因進行PCR擴增鑒定, 擴增出405 bp的目的片段; 將PCR產物進行測序, 所得序列在GenBank用BLAST進行同源序列搜索并上傳至GenBank(18S rRNA基因登錄號為KY321842、COⅠ基因登錄號為KY321844和COB基因登錄號為KY321843), 分別與L. intestinalis三種基因具有較高的同源性(表 2), 結果表明疑似樣品在分子生物學上鑒定為L. intestinalis。

2.2 基因同源性比較分析

用Clustal Omega在線軟件的Clustal2.1方法, 將本研究鑒定克隆序列KY321842 (18S rRNA基因序列)、KY321844 (COⅠ基因序列)和KY321843(COB基因序列)與已上傳到GenBank上的L. intestinalis核苷酸序列分別進行同源性比較(表 2), 結果表明18S rRNA基因序列與AF254121 (中國)、KC900974 (伊朗)的核苷酸序列同源性分別為100.00%和98.99%;COⅠ基因序列與AF153910 (中國)、JQ279102 (突尼斯)、JQ279074 (阿爾及利亞)的核苷酸序列同源性分別為99.49%、93.38%和93.13%, 與EU241310 (俄羅斯)、EU241238 (烏克蘭)、JQ279085 (愛沙尼亞)、EU241303 (英國)的核苷酸序列同源性分別為92.62%、92.37%、92.11%和91.86%;COB基因序列與JQ279109 (阿爾及利亞)、JQ279139 (突尼斯)、EU241200 (法國)、EU241218 (烏克蘭)的核苷酸序列同源性分別為93.32%、93.07%、89.88%和89.60%。同源性比較分析發現, 不同基因的分子標記得出的結論可能不同, 核基因分子標記顯示物種變異小, 而線粒體基因標記則顯示物種差異較大; 本研究鑒定的分離株與我國的分離株(18S rRNA基因和COⅠ基因, Gen-Bank中未有我國COB基因記錄)序列同源性較高,同時發現L. intestinalis在亞洲(中國和伊朗)、歐洲(烏克蘭、俄羅斯、英國和法國)、非洲(突尼斯和阿爾及利亞)都曾被發現并鑒定。

2.3 系統進化分析

選取GenBank已發表的相應序列運用MEGA5.0中的鄰近法構建包含分離株的3種基因的相應進化樹(圖2—4)。基于18S rRNA基因構建的進化樹顯示: 本研究鑒定克隆的序列KY321842與AF254121中國分離株聚成一支, 也與雙線絳蟲AF254122中國分離株聚在一大支; 同樣L. intestinalis伊朗分離株(KC900976/77)與雙線絳蟲伊朗分離株(KC 900985/89/91)也聚在一支上,L. intestinalis伊朗分離株(KC900972/4/5/8)與雙線絳蟲伊朗分離株(KC9009/82/84/86/87/88/92/94)也聚在一支上; 同時發現舌狀絳蟲、雙線絳蟲中國分離株與伊朗的分離株是分開的, 分別聚成兩大類群。基于COⅠ基因的進化樹顯示: 克隆序列KY321844與AF153910舌狀絳蟲中國分離株聚成一小分支, 也與AF524041雙線絳蟲中國分離株聚在一支; 舌狀絳蟲突尼斯(非洲)分離株與其他歐洲國家的舌狀絳蟲分離株聚在一支。基于COB基因的進化樹顯示: 克隆序列KY321843與舌狀絳蟲阿爾及利亞分離株(JQ279109/13)和舌狀絳蟲突尼斯分離株(JQ279138/39/40)聚在一大支; 同時發現舌狀絳蟲分離株(EU241218和JQ279123)與雙線絳蟲分離株(EU241153/209)聚在一大支。結果表明, 本研究鑒定的舌狀絳蟲分離株(青海)與舌狀絳蟲中國分離株(廣州)種屬親緣關系較近, 與其他絳蟲所屬分支相隔較遠, 在進化上得到了很好的鑒別; 中國分離株在進化上與其他地區的分離株遺傳進化距離較遠。

表 2 三種不同基因與其參考序列的核苷酸序列的同源性比較Tab. 2 The homology comparison of nucleotide sequences of three different genes and reference sequences

圖2 基于18S rRNA基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹(NJ樹)Fig. 2 The Neighbor-Joining phylogenetic tree based on nucleotide sequences of 18S rRNA gene

圖3 基于COⅠ基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹(NJ樹)Fig. 3 The Neighbor-Joining phylogenetic tree based on nucleotide sequences of COⅠgene

圖4 基于COB基因序列以鄰近法所構建的系統發育樹(NJ樹)Fig. 4 The Neighbor-Joining phylogenetic tree based on nucleotide sequences of COB gene

從3個進化樹的分支狀況還可發現, 不同地區的舌狀絳蟲和雙線絳蟲雖然存在分支跨越, 但是均聚在一個大的分支上, 與其他屬種明顯分開。這些結果還表明, 18S rRNA和COⅠ基因均可用于舌狀絳蟲種的系統發育研究。

3 討論

本研究利用18S rRNA、COⅠ和COB基因進行了舌狀絳蟲的分子鑒定。L. intestinalis核基因組中的18S rRNA基因蟲種間的同源性較高(表 2), 而線粒體基因組中的COⅠ和COB基因的同源性較低(表2); 而數據顯示同一地區的蟲種的線粒體基因的同源性較高。可見, 不同基因分子標記可能得出不同的結論, 特別核基因和線粒體基因, 核基因分子標記顯示蟲種變異小, 而線粒體基因標記則顯示蟲種差異較大; 同時發現Digrammaspp.的線粒體基因與Ligulaspp.的線粒體基因同源性也較高。Li等[7]研究認為傳統分類學上Ligula分為2個屬(Ligula Bloch1782和Digramma Cholodkovsky1914)也是有爭議的, 在基因序列水平上,Digrammaspp. 種的28S rRNA基因和COⅠ基因序列與Ligulaspp.的序列相似性是一致的; 只在ITS1基因和ND1基因上分別有0.7%和7.4%的不同。28S rRNA、COⅠ、ITS1和ND1基因都是高度保守的,Digrammaspp.與Ligulaspp.之間的4個基因的低遺傳分歧表明Digrammaspp.可能不是獨立的屬, 還認為中國不同地方采集的Digrammaspp.應屬于Ligulaspp.[7], 這與本研究有一定的一致性(圖2—4)。同樣, Logan等[8]研究認為裂頭科中的舌狀屬(Ligula)、雙線屬(Digramma)和裂頭屬(Diphyllobothrium)等分類有效性需修訂, 認為雙線屬(Digramma)應屬于舌狀屬(Ligula),為一個分類群的復合體, 這與本研究的結果中, 不同地區的舌狀絳蟲分離株和雙線絳蟲的分離株都有聚在一支上的現象相吻合(圖2—4)。

Bouzid等[5—9]研究認為發現, 宿主特異性和地理隔離是促使舌狀絳蟲種系進化的重要力量, 在歐洲-地中海不同的地區同時存在有宿主特異性的舌狀絳蟲和地理特異性的舌狀絳蟲; 如在埃塞俄比亞塔納湖同一水域卻同時存在著兩種種系的舌狀絳蟲。在本研究中, 可見明顯的地理特異性的舌狀絳蟲種系存在, 舌狀絳蟲中國分離株均聚在同一支進化樹上(圖2和圖3)。同時, 不同的歐洲地理株型上大體均聚在一大分支上, 表現了一定的聚集遺傳關系, 有較弱的遺傳進化關系。終末宿主候鳥均存在頻繁遷移現象, 寄生的舌狀絳蟲種群種系卻較為均一, 而在宿主魚中的舌狀絳蟲不同地區卻有多樣化的種群種系關系, 這可能與適應地中海的高濃度鹽水的魚種特異性有關, 魚群不能夠長距離的遷移,阻礙了舌狀絳蟲的基因交流[5—9]; 這與青海湖高緯度高鹽度冷水湖的裸鯉相似, 寄生于裸鯉的舌狀絳蟲具有了地理株型的特異性。Britton等[10]研究也發現, 在肯尼亞的巴林戈納湖和奈瓦夏流域的不同宿主中表現出舌狀絳蟲進化的高度宿主特異性。

本研究對我國青海湖特有魚種青海湖裸鯉體內感染的L. intestinalis幼蟲的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列進行克隆測序列并進行了分子鑒定;同時, 運用3種基因進行了裂頭科常見屬種之間的分子系統發育初步探究, 比較了主要蟲種間基因的序列同源性, 得到了系統發育樹, 初步闡明了鑒定種與其他種屬之間的系統發育關系。

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