水環境中磺胺嘧啶脅迫下異育銀鯽的組織病理學研究

鄭婷婷 涂宗財, 唐平平 張 露 沙小梅 王 輝

(1. 江西師范大學生命科學學院, 功能有機小分子教育部重點實驗室, 南昌 330022;2. 南昌大學食品與科學技術國家重點實驗室, 南昌 330047)

磺胺類藥物是一類具有對氨基苯磺胺結構的藥物的總稱, 因其價值低廉同時具有廣譜殺菌功能而被大量應用于人類和動物疾病的治療[1]。1932年,磺胺類藥物首次用于臨床試驗, 而近幾年在中國的產量已經達到每年2—5×107kg[2]。研究表明, 在中國海河流域、遼河盆地及其鄰近的遼東灣的地表水和廢水中磺胺類藥物頻繁被檢測出, 檢測濃度為8.4 ng/L—211 μg/L[3,4]。有文獻報道, 美國USGS調查了抗生素濫用較嚴重地區的污水、飲用水以及地表水中抗生素的含量, 其中磺胺類藥物的檢出率最高[5]。人類長期受磺胺類藥物污染, 會出現排尿和造血紊亂等一系列健康問題[6]。另外, 由于磺胺類藥物在人體中的代謝時間較長, 容易導致耐藥性的產生, 并且具有潛在的致癌性, 對人類健康產生了嚴重的安全隱患[7,8]。

目前, 國內外有關磺胺類抗生素的研究多停留在藥代動力學以及痕量檢測方面, 其在生態毒理學方面的研究也越來越受到重視。有研究報道, 磺胺嘧啶的攝入對斑馬魚的孵化、心率及自主運動均具有不良影響[9,10]。謝美萍等[11]發現低濃度下的磺胺類藥物會對斑馬魚的代謝功能產生影響。然而,對水環境中的磺胺類抗菌藥物進入水生生物體后對其各組織的病理變化卻少有研究。異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)是我國淡水魚養殖的主要種類之一, 因其生長快, 周期短, 營養價值高, 味道鮮美等優點被人們所喜愛, 產量較大。水環境中磺胺嘧啶對異育銀鯽的組織病理學研究未見報道,因此, 本實驗以磺胺類抗菌藥物中比較具有代表性的磺胺嘧啶為實驗藥物, 將異育銀鯽分別在含不同濃度磺胺嘧啶的水環境中飼養28d, 觀察其肝臟、腎臟、鰓、腸、肌肉等組織的病理變化, 旨在探討水環境中磺胺嘧啶作用下對異育銀鯽的組織病理變化規律, 為異育銀鯽的健康養殖和磺胺嘧啶的科學合理用藥提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

儀器與試劑儀器: JJ-12J脫水機, 武漢俊杰電子有限公司; JB-P5 包埋機, 武漢俊杰電子有限公司; RM2016 病理切片機, 上海徠卡儀器有限公司;JB-L5 凍臺, 武漢俊杰電子有限公司; KD-P組織攤片機, 浙江省金華市科迪儀器設備有限公司; DHG-9140A烤箱, 上海慧泰儀器制造有限公司; 10212432C載玻片及蓋玻片, 江蘇世泰實驗器材有限公司;Nikon Eclipse CI正置光學顯微鏡, 日本尼康; Nikon DS-U3 成像系統, 日本尼康;

試劑: 無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠購于國藥集團化學試劑有限公司; 蘇木素-伊紅染液購于武漢谷歌生物科技; 甲醛購于天津市大茂化學試劑廠。

試驗生物異育銀鯽由南昌市某養殖場提供, 平均體重(25±2) g。采用實驗室模擬半靜態法對其進行馴養, 試驗用水為經曝氣去氯處理24h的自來水, 為保持試驗藥液的濃度不低于起始濃度的80%, 試驗期間每隔24h更換藥液1次, 水溫保持在(20±1)℃, pH為 7.02—7.25左右。馴養期間, 每天正常喂食, 每次投放飼料的量不超過魚體重的1%。魚體在正式實驗開始前對其進行為期1周的馴養。

1.2 方法

試驗設計因實驗中藥品的影響質量濃度一般為μg/L至mg/L水平, 同時結合水體中磺胺類藥物的檢出濃度, 所以設置了高、中、低3個質量濃度梯度和1個空白對照: 0、1 μg/L、100 μg/L、10 mg/L。

樣品處理魚體的染毒方式采用靜態水質接觸染毒。于暴露后的第7、第14、第21、第28天,分別從對照組和實驗組隨機取出3條魚, 解剖取出腎臟、腸、鰓、肝胰臟、肌肉固定于10%的中性福爾馬林中24h后, 用石蠟包埋, 連續切片(4 μm)。將烘干的切片依次放入二甲苯、酒精中進行脫蠟處理, 取出切片用蒸餾水沖洗, 然后進入染色階段。病理切片采用蘇木精-伊紅(HE)染色, 中性樹膠封片后用顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 肝臟組織病理變化

不同濃度的磺胺類藥物處理對異育銀鯽肝臟組織的影響如圖1所示。空白組的肝臟組織切片如圖1L所示, 其結構完整、清晰, 包括完整的中央靜脈、肝小葉、肝血竇等結構。肝細胞呈多角狀, 體積雖有大小不同, 但形狀均無差異, 圍繞著中央靜脈整齊緊密排列。細胞界限清楚, 細胞質染色較細胞核淺且均勻, 圓形細胞核大而規則, 基本位于細胞中央。肝上皮細胞、肝血竇內皮細胞、紅細胞等各類細胞健康無損傷。磺胺嘧啶暴露7d后, 低濃度(1 μg/L)組和中濃度(100 μg/L)組肝臟組織除了出現中央靜脈和肝血竇輕度充血外, 基本沒有出現其他損傷和異常。高濃度(10 mg/L)組肝細胞腫脹、部分肝細胞出現空泡化, 少數細胞核偏離細胞中央靠近細胞一側, 另外部分區域肝細胞索模糊。磺胺嘧啶暴露14d后, 肝臟組織損傷較暴露7d更為嚴重,低濃度和中濃度處理組肝細胞腫脹, 空泡化, 細胞間隙增大, 中央靜脈、肝血竇和肝小葉間出現淤血。高濃度處理組的肝組織則大量炎性細胞浸潤,肝細胞空泡化, 溶解, 崩潰, 造成部分局灶性壞死。磺胺嘧啶處理21d后, 各濃度組肝臟組織出現嚴重損傷, 表現為中央靜脈和肝血竇淤血嚴重, 大量炎性細胞浸潤, 嚴重的較大面積的肝細胞壞死。28d后, 各濃度處理組肝臟組織損傷較為相似, 除肝血竇和中央靜脈淤血外, 細胞腫大嚴重, 細胞間隙擴大, 嚴重空泡化, 細胞核固縮甚至消失, 細胞壞死。

2.2 腎臟組織病理變化

不同濃度的磺胺類藥物處理對異育銀鯽腎臟組織的影響如圖2所示。空白組腎臟組織(圖2K)實質均勻, 結構完整, 具有清晰可見的腎小球和腎小管。腎小管由排列整齊且緊密的上皮細胞組成, 中間為管腔, 腎小球中央為一團毛細血管, 最外層為腎小囊, 兩者之間為囊腔, 各類細胞基本無損傷。磺胺嘧啶處理7d后, 低、中、高濃度處理組均發生了較為相似的損傷, 腎小管上皮細胞腫大, 與正常組相比腎小管上皮細胞排列較為疏松, 腎小球和腎間質輕微出血。另外, 中、高濃度組腎臟組織腎小管腔隙變大。14d處理后, 低濃度組腎小管細胞排列稀疏, 上皮細胞空泡化嚴重, 腎小球淤血, 部分腎小球細胞壞死, 溶解, 腎間質血細胞出現淤血,細胞出現滴狀玻璃樣變性。中濃度和高濃度組, 腎小管上皮細胞腫大, 空泡化, 壞死, 腎小管腔變小,甚至消失。部分腎小球細胞壞死, 腎小球崩解, 結構破壞, 腎間質組織出現壞死區。21d處理后, 低濃度組腎臟組織充血明顯。中濃度和高濃度組的腎間組織細胞空泡, 溶解, 壞死嚴重, 出現較大面積空白。高濃度組的腎小管上皮細胞空泡樣變性嚴重,腎小球淤血, 腎間組織空泡, 壞死, 淤血嚴重。28d處理后, 低濃度組與之前損傷無顯著差異。中濃度和高濃度組的腎臟組織損傷更為嚴重, 腎小管上皮細胞核固縮, 嚴重的腎小管組織失去原有結構,出現壞死, 腎間組織細胞空泡, 出現大片壞死。

圖1 肝臟的組織病理Fig. 1 Histopathology of liver (×200)

圖2 腎臟的組織病理×200Fig. 2 Histopathology of kidney×200

2.3 鰓組織病理變化

不同濃度的磺胺類藥物處理對異育銀鯽鰓絲結構的影響如圖3所示。空白組的鰓絲表面平緩舒展, 鰓小片分布均勻、梳妝排列整齊, 結構完整, 長短均勻, 各類細胞基本無損傷、脫離(圖3G)。不同濃度的磺胺嘧啶對鰓組織結構具有不同程度的損傷, 表現出一定的時間和劑量效應。磺胺嘧啶暴露7d后, 各濃度組均出現較為輕度的損傷, 具體表現為鰓小片上皮細胞出現腫脹、鰓小片基部上皮細胞不同程度增生。中濃度組鰓小片上皮細胞脫落,導致鰓小片變短。高濃度組鰓小片無規則扭曲。14d后, 低濃度組鰓小片間上皮細胞增生持續加重,部分充滿鰓小片的間隙。中濃度組, 鰓小片間細胞增生嚴重, 使鰓絲成板狀, 鰓小片變短, 但依然存在。高濃度組鰓組織損傷嚴重, 鰓小片結構消失,鰓絲部分細胞壞死。21d后, 低濃度組鰓小片充血嚴重。中濃度組鰓小片結構消失。28d后各濃度組鰓組織病理變化與21d的無明顯差別 。

圖3 鰓的組織病理×400Fig. 3 Histopathology of gills×400

2.4 腸道組織病理變化

不同濃度的磺胺類藥物處理對異育銀鯽腸道絨毛結構的影響如圖4所示。空白組的異育銀鯽的腸道絨毛完整, 排列整齊緊密, 各類細胞無明顯損傷(圖4G)。磺胺嘧啶處理7d后, 低濃度處理組的肌層血細胞增多, 黏膜下層增厚, 黏膜上皮細胞變性,細胞排列疏松, 微絨毛變短, 部分區域微絨毛結構破壞, 脫落。中濃度組的腸道組織比低濃度組損傷更為嚴重, 除黏膜下層增厚外, 出現較多壞死區域;固有層細胞腫大, 且出現較多空泡化細胞; 部分黏膜皺襞破損, 甚至裂開; 黏膜層層上皮細胞變性壞死, 甚至溶解, 潰爛, 導致微絨毛損壞, 腸腔內出現較多脫落的微絨毛。高濃度組損傷和中濃度組相類似, 均比較嚴重。處理14d后, 各濃度組腸道組織病變具有較大的緩解, 腸道結構較為完整, 只有少部分微絨毛脫落, 然而隨著磺胺嘧啶暴露時間的累加, 腸道組織又出現較大的損傷。處理21d后, 中高濃度組的杯狀細胞增多, 腸道上皮細胞空泡, 壞死導致部分微絨毛脫落, 黏膜皺襞相互融合, 連接。固有層細胞變性, 壞死, 導致固有膜結構消失。處理28d后, 低濃度組的腸道依舊損傷較小, 肌層部分區域出現空泡化壞死細胞和黏膜層杯狀細胞增多,而中高濃度組損傷和21d相差不大, 表現為持續損傷。

2.5 肌肉組織病理變化

不同濃度的磺胺類藥物處理對異育銀鯽肌肉組織結構的影響如圖5所示。空白組肌肉組織的肌纖維呈多角形, 含有多個細胞核, 排列緊致有序(圖5M)。磺胺嘧啶處理7d后, 低濃度組有輕度損傷, 表現為肌纖維間隙變寬, 肌纖維輕微彎曲并有縫隙。中濃度組的肌肉組織損傷增大, 肌纖維輕微變性,腫大, 部分相鄰肌纖維出現聚集, 呈團塊狀, 肌纖維疏松, 彎曲, 甚至斷裂。高濃度組的肌纖維斷裂, 甚至溶解, 壞死, 出現一些空白的孔洞, 橫紋模糊。14d處理后, 低濃度組的肌纖維彎曲斷裂, 表面孔洞較多。中濃度組和高濃度組損傷類似, 肌纖維彎曲、斷裂嚴重。經高濃度21d和28d處理的異育銀鯽的肌纖維溶解, 崩潰, 并出現碎片化。

圖5 肌肉的組織病理×100Fig. 5 Histopathology in muscle ×100

3 討論

磺胺嘧啶為廣譜抗菌類藥物, 目前國內外用于水產動物疾病防治的磺胺藥物有十多種, 而磺胺嘧啶為其中比較具有代表性的一種, 用量較大, 易殘留于水環境, 造成污染, 同時可能會引起水生生物組織結構的病變。本實驗異育銀鯽在磺胺嘧啶暴露后, 肝臟、腎臟、鰓、腸道、肌肉均發生了不同程度的損傷, 其中肝臟、鰓、腎臟損傷尤為嚴重,且磺胺嘧啶處理時間的延長, 劑量的增加會導致組織損傷加重。

肝臟是魚類維持生命活動和代謝的實質性組織器官, 具有解毒和防御功能, 外來污染物質可在肝臟組織進行代謝和生物轉化, 過量的毒性物質會對肝臟造成不同程度的損傷[12]。肝臟組織中含有大量的酶, 肝臟受到病理損傷時易改變酶的活性。磺胺類藥物大多易在肝臟發生乙酰化, 造成過高濃度時可能會影響肝臟組織酶的活性, 進而引發組織病理變化。本實驗表明, 磺胺嘧啶對異育銀鯽肝臟組織具有損傷作用, 表現為肝組織淤血, 炎性細胞浸潤, 空泡化, 嚴重的出現肝細胞核固縮, 溶解, 大面積壞死等。大量的研究也表明水環境中的一些污染毒性物質易引發魚類肝臟組織造成本實驗所出現的損傷。Zodrow等[13]研究發現, 斑馬魚在受到二噁英類化合物TCDD毒性作用后, 肝臟組織出現肝細胞腫大, 壞死, 細胞數量減少等現象。王荻等[14]研究表明諾氟沙星可造成肝細胞腫脹、核固縮甚至肝細胞消溶等損傷。張濤等[15]研究發現, 水中高濃度的氨氮、亞硝酸鹽會引發黃穎魚肝臟組織局灶性壞死。韓冰等[16]研究阿維菌素對松浦鏡鯉的組織病理變化, 結果發現阿維菌素可造成肝臟組織肝血竇淤血, 細胞質變淡, 細胞核溶解消失。

腎臟是魚體重要的排泄和免疫器官, 具有調節內環境使其保持穩定的功能。腎臟組織發生病變后, 易造成內環境酸堿、體液、內分泌等功能異常,進而損害魚體健康生長[17]。磺胺類藥物及其代謝產物難溶于水, 經腎臟排泄時易析出晶體, 造成腎小管堵塞, 引起腎臟發生病變[18]。異育銀鯽在磺胺嘧啶環境中暴露后, 腎臟組織出現持續的病理損傷,表現為腎小管上皮細胞空泡化, 腎小球細胞壞死,腎間質淤血, 出現壞死區等。研究表明[19], 羅非魚感染海豚鏈球菌病后腎小管上皮細胞發生水腫, 壞死, 與本文損傷較為一致。腎小管上皮細胞腫脹,壞死, 易腎組織的滲透作用削弱, 進而引起排泄異常, 嚴重導致腎功能衰竭。另外, 還有研究表明[20],腎臟組織遭受病理損傷后, 血漿中滲透壓平衡打破,導致滲透壓降低, 引起腎臟組織淤血, 與本實驗結果相符合。

鰓是魚類的呼吸器官, 具有氣體交換, 調節體內滲透壓、酸堿、離子平衡, 排泄一些含氮廢棄物等多種重要功能。魚鰓在呼吸過程中與外界水環境直接接觸, 也極敏感, 易受水環境中化學、物理、生物等污染物影響, 造成組織病理損傷。水環境中污染物對魚鰓的損傷作用主要包括兩種, 一種是防御反應產生的損傷, 包括上皮細胞腫大, 鰓小片隆起等, 另一種是藥物直接損傷, 如上皮細胞壞死脫落, 鰓結構破壞等[21,22]。在本實驗中, 根據異育銀鯽經磺胺嘧啶脅迫后產生的病理變化, 推測可能前期主要為防御反應損傷, 后期為直接損傷。大量研究表明, 水環境中的污染物對魚鰓具有毒性作用, 極易造成病理損傷。Biagini等[23]研究表明水中污染物會對羅非魚鰓組織造成鰓小片頂端膨大, 基部融合等與本文相似的病理變化。王曉光[24]研究了4種不同濃度的溴氰菊酯暴露對斑馬魚鰓組織的病理變化, 經溴氰菊酯暴露后鰓小片上皮細胞腫脹,增生, 頂端膨大, 嚴重者基部發生融合。而鰓小片上皮細胞增生嚴重會影響魚正常呼吸和分泌等, 甚至引起魚體缺氧, 嚴重影響魚健康生長[25]。重金屬污染也易使魚鰓發生組織病變, 聶志娟等[26]發現暴露在3 mg/mL的Cu2+環境中刀鱭幼魚的鰓損傷較為嚴重, 毛細血管充血, 鰓小片發生脫落。鰓組織損傷后易感染一些致病菌, 引發新的疾病, 因此養殖魚類在使用抗生素類藥物時, 應避免因用藥造成鰓組織損傷。

腸道是魚類消化吸收營養物質的場所, 腸道組織健康對魚類生長至關重要。腸道組織發生病變后, 易造成魚體營養不良, 生長滯緩, 對魚類養殖危害巨大。異育銀鯽在磺胺嘧啶的水體中暴露, 腸道組織產生相關病理變化, 表現為腸道微絨毛脫落,黏膜下層增厚, 黏膜皺襞出現破損等。腸道黏膜皺襞的高低疏密, 微絨毛的發達程度, 杯狀細胞數量多少都對魚體消化吸收能力具有影響作用[27]。因此, 磺胺嘧啶暴露后微絨毛脫落, 黏膜皺襞破損均會影響魚體的消化吸收。然而, 磺胺嘧啶暴露14d后, 其腸道組織損傷反而減少, 這可能是因為魚體自身在應對外界毒性物污染后, 會啟動應激反應,產生一定的適應性。但是, 隨著磺胺嘧啶暴露時間的持續加長, 依然會對腸道組織產生不同程度的損傷。Puerto等[28]研究報道水環境中微囊藻毒素會導致羅非魚腸道組織發生上皮細胞脫落, 絨毛和微絨毛結構破壞等病理變化。

魚肌肉是人類動物蛋白質的重要來源, 肌肉組織發生病變損傷會使肌肉品質下降。另外, 肌肉組織主要負責魚體各種的運動功能, 肌肉組織病變異常的會引起魚的運動能力下降。在本實驗中, 隨著異育銀鯽在磺胺嘧啶水體中暴露時間的延長, 濃度的增大, 肌肉組織損傷不斷加重, 表現為肌纖維排列疏松, 紊亂, 甚至斷裂等。陳濤等[29]研究氰戊菊酯對鲇魚肌肉組織的病理損傷影響, 發現氰戊菊酯會導致鲇魚肌肉組織表面疏松, 肌纖維不規則, 肌纖維間隙變大等, 這與本實驗結論相一致。陳秀榮的研究[30]也發現氰戊菊酯會引發草魚肌纖維排列紊亂, 疏松, 不規則等病變。

綜上, 水環境中磺胺嘧啶會對異育銀鯽產生不同程度的組織病理損傷, 其中肝臟、鰓、腎臟組織損傷程度大, 而且隨著磺胺嘧啶暴露時間的延長、濃度的加大, 各組織的病理損傷更為嚴重。

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