尼羅羅非魚Ikaros基因的克隆及表達分析

陳昆平 劉志剛 盧邁新 高風英 張德鋒 可小麗曹建萌 朱華平 王 淼 衣萌萌

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所, 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室, 廣州 510380;2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

DNA結合蛋白Ikaros家族是具有C2H2鋅指結構的轉錄因子, 它包括Ikaros、Aiolos、Helios、Ecos和Pegasus等5個成員, 它們對淋巴細胞及其他造血細胞的早期發生和發育具有重要的調控作用[1]。其中, 由Ikaros基因編碼的Ikaros是preBCR、Notch、MAPK等多個信號通路中的關鍵轉錄因子,通過FOXO1、HuD、ETS1等調控因子的相互作用來調控大量與淋巴細胞發育相關的下游基因的表達, 對于淋巴細胞的正確發育及其免疫功能的發揮具有重要作用[2]。研究表明, 當小鼠(Mus musculus)的Ikaros基因發生突變時, 多能造血干細胞不能分化為淋巴樣祖細胞, 其體內將缺失B細胞、NK細胞、外周淋巴結和早期的T細胞[3,4]。Winandy和Payne等[5,6]認為Ikaros基因是一個腫瘤抑制基因,Ikaros活力的喪失會導致前B細胞轉化為惡性狀態,腫瘤發生的概率大大增加。在人類(Homo sapiens)中,Ikaros基因的缺失及功能性突變在急性淋巴細胞白血病的發生發展中發揮重要作用, 而且與惡性腫瘤、系統性紅斑狼瘡等疾病的發生密切相關[7—9]。

羅非魚(Tilapia)是聯合國糧農組織(FAO)重點推廣養殖的對象, 被譽為未來動物性蛋白質主要來源之一, 因具有適應性強、生長快、繁殖力高和食性廣等優點, 已被世界各地廣泛引種與養殖[10]。但近年來由于羅非魚鏈球菌病的頻繁發生與流行, 給羅非魚養殖產業造成了巨大的經濟損失[10,11]。開展羅非魚免疫相關基因的研究可為探索羅非魚免疫防御機制及抗病品種培育奠定基礎, 對羅非魚病害防治具有重要意義。目前有關羅非魚免疫相關基因轉錄調控因子的研究還比較薄弱, 羅非魚Ikaros基因的研究尚未見報道。開展羅非魚Ikaros基因結構、功能及免疫應答特性的研究, 有助于全面了解羅非魚免疫系統防御特點以及進一步揭示免疫轉錄因子在抵御病原感染中發揮的調控作用。本研究利用RT-PCR和RACE等技術, 對尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus, GIFT strain)Ikaros基因進行了克隆, 并對其進行生物信息學分析, 同時采用實時熒光定量PCR技術檢測了Ikaros基因在尼羅羅非魚各個組織中的表達情況及其在人工感染無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)后免疫相關組織中的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚: 尼羅羅非魚來自廣東羅非魚良種場, 體質量為30—50 g, 在珠江水產研究所的池塘網箱中暫養一周后用于試驗。

菌株: 無乳鏈球菌菌株WC1535由本實驗室分離保存, 為Ⅰa型強毒株。

實驗試劑:Escherichia coliDH5α感受態細胞、pMD19-T載體和反轉錄試劑盒購自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司; RNA提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司; DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;PowerUpTMSYBR?Green Master Mix試劑盒購自英濰捷基(上海)貿易有限公司; SMARTTMRACR cDNA Amplification kit和Genome WalkerTMUniversal Kit購自美國Clontech公司; 常規PCR所用的TaqDNA polymerase、dNTP mixture和Buffer for Tap DNA Polymerase購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

尼羅羅非魚Ikaros基因組DNA序列及其cDNA序列的克隆在無菌條件下, 解剖尼羅羅非魚取胸腺組織, 采用Magen High Pure Universal RNA Kit(Magen)試劑盒提取總RNA, 步驟參照試劑盒說明書進行, 瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性, 并用超微量分光光度計檢測其濃度和純度。取1 μg胸腺RNA, 采用Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)將其反轉錄為cDNA。采用TIAN-amp Marine Animals DNA Kit (TIANGEN)試劑盒提取尼羅羅非魚的尾鰭基因組DNA。

參照尼羅羅非魚IkaroscDNA的預測序列(登錄號為: XM_005473805)設計PCR擴增和RACE所需要的引物(表 1), 本實驗所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以胸腺組織cDNA為模板, PCR擴增Ikarosc DNA序列片段。Ikaros基因cDNA 5′末端和3′末端的擴增按照SMARTTMRACR cDNA Amplification kit (TaKaRa)的操作手冊進行。參照尼羅羅非魚Ikaros基因的預測序列(登錄號為: NC_022211)和已獲得的cDNA序列設計4對特異性引物(表 1), 以尾鰭組織基因組DNA為模板, PCR擴增Ikaros基因組DNA序列片段。Ikaros基因5′側翼序列采用Genome WalkerTMUniversal Kit(Clontech)試劑盒進行擴增。PCR產物膠回收純化后與載體pMD19-T連接, 轉化E.coliDH5α感受態細胞中, 陽性單克隆送至Invitrogen公司測序, 通過序列拼接獲得IkaroscDNA序列和基因組DNA序列全長。

表 1 用于尼羅羅非魚Ikaros基因克隆和表達的主要引物及其序列Tab. 1 Primers used for charactering the Ikaros gene in O. niloticus

尼羅羅非魚Ikaros基因的表達分析在無菌條件下, 解剖3尾健康尼羅羅非魚取血液、胸腺、脾臟、頭腎、鰓、心臟、腦、腸、肌肉、皮膚和肝臟等11個組織, 按照1.1中方法提取各組織的總RNA, 并取1 μg RNA, 反轉錄為cDNA。以EF-1α基因作為熒光定量PCR的內參基因, 用于擴增的引物為EF-1α sf2和EF-1α sr2; 在Ikaros6種mRNA剪接異構體的共有序列中設計熒光定量引物(Ik-Q852F和Ik-Q1019R), 引物序列詳見表 1, 按照1.1中方法進行目的片段的克隆, 將重組質粒按10倍梯度稀釋為8個濃度梯度, 并將其作為制作標準曲線的模板。每個cDNA樣品設置3個重復, 反應體系按照SYBR Green Mix (ABI)試劑盒的說明書進行配制,使用ABI Step One Plus熒光定量儀檢測Ikaros基因在各組織中的表達水平。qRT-PCR檢測的結果使用Excel軟件進行數據處理, 采用2-ΔΔCt法計算單個樣品中Ikaros基因的相對表達量, 并利用SPPS17.0軟件中單因素方差分析進行Ikaros基因表達水平的差異性分析,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后Ikaros基因在各組織中的表達變化將無乳鏈球菌種接種于血平板, 30℃培養16h后用PBS緩沖液稀釋菌體配置成濃度分別為5×105、1×106、5×106、1×107和5×107CFU/mL的菌液。將不同濃度的菌液分別注射于尼羅羅非魚腹腔中, 每組30尾, 每尾100 μL, 對照組注射等量PBS緩沖液, 獲得半致死濃度為5×106CFU/mL。將個體大小相近的150尾尼羅羅非魚分別置于5個體積為0.3 m3的魚缸中, 每缸30尾魚,水溫控制為(31±0.5)℃, 每天正常投喂2次, 馴養1周后以半致死濃度的無乳鏈球菌菌液進行人工感染實驗。其中, 3個魚缸中的尼羅羅非魚設置為無乳鏈球菌感染組, 每尾腹腔注射100 μL無乳鏈球菌菌液, 另外2個魚缸中的尼羅羅非魚腹腔注射100 μL PBS緩沖液, 作為對照組。在0、8h、24h、48h、72h、120h、192h和288h共8個時間點, 分別收集無乳鏈球菌感染組和PBS對照組不同時間點3尾魚的血液、胸腺、頭腎和脾臟4種組織, 按1.3中建立的熒光定量PCR方法檢測Ikaros基因在各組織中的表達變化。

生物信息學分析基因測序結果利用DNAMAN和NCBI數據庫中Blast等軟件進行比對分析,蛋白理化性質利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)進行分析, 信號肽預測使用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),跨膜區分析使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), 疏水性分析使用Ex-PASy ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/), 糖基化位點預測使用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/), 磷酸化位點預測使用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/), 蛋白結構域分析采用Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/), 蛋白質三級結構的構建與分析采用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/workspace/)和Insight II軟件, 利用DNAstar和BioEdit軟件進行氨基酸序列的多重比對, 利用MEGA5.05軟件中的鄰位相接法(Neighborjoining)構建系統進化樹。

2 結果

2.1 尼羅羅非魚Ikaros的cDNA序列及其特征

本實驗利用RT-PCR和RACE技術對尼羅羅非魚IkaroscDNA進行了克隆, 發現該基因具有6種不同的mRNA剪接異構體, 分別為Ikaros-1、Ikaros-2、Ikaros-3、Ikaros-4、Ikaros-5和Ikaros-6, 其cDNA序列已經提交到GenBank, 登錄號分別為KY825170、KY825171、KY825172、KY825173、KY825174和KY825175, 序列組分及其蛋白質的理化性質包括cDNA全長(Full length cDNA, FLC)、5′非翻譯區(Untranslated region, UTR)、3′UTR、開放閱讀框(Open reading frame, ORF)、氨基酸(Amino acid, AA)、蛋白質分子量(Protein molecular weight, Mr)和等電點(Isoelectric point, pI)的分析如表 2所示。使用TMHMM、Expasy和SignalP生物軟件對Ikaros基因編碼的氨基酸序列進行分析,結果發現它們均無疏水區域、無跨膜區域和無信號肽。利用NetPhos 3.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server生物軟件對Ikaros-1編碼的氨基酸序列進行預測, 結果發現該序列有46個絲氨酸磷酸化位點、18個蘇氨酸磷酸化位點、4個酪氨酸磷酸化位點以及2個糖基化位點, 分別為39NASA和195NGSQ。

2.2 尼羅羅非魚Ikaros的基因組DNA序列及其mRNA剪接異構體

通過PCR和Genome walking技術克隆獲得Ikaros的基因組DNA (GenBank登錄號: KY825169),結果顯示該序列全長為20454 bp, 包括3721 bp的5′側翼序列、8個外顯子和7個內含子, 且連接處均符合GT-AG規律。對Ikaros6種不同的mRNA剪接異構體進行比對分析, 發現Ikaros-1和Ikaros-2包含8個外顯子,Ikaros-3缺失第7外顯子,Ikaros-4和Ikaros-5缺失第4外顯子,Ikaros-6缺失了第4和第7外顯子, 而Ikaros-2和Ikaros-5則分別在第7外顯子的5′末端比Ikaros-1和Ikaros-4少3個堿基(TAG), 從該結果可看出Ikaros基因的第4和第7外顯子為可變剪接外顯子, 且第7外顯子的剪接位置可發生在其頭3個堿基之后(圖1)。

2.3 尼羅羅非魚Ikaros蛋白的結構分析

Smart預測尼羅羅非魚Ikaros蛋白的結構域, 結果顯示Ikaros-1、Ikaros-2和Ikaros-3編碼的蛋白質異形體(Ik1、Ik2和Ik3)均具有6個保守的鋅指結構域(Zinc finger domains, ZnFs), 其中4個ZnFs位于N端, 由Ikaros基因的4—6外顯子編碼, 另外2個Zn-Fs位于C端, 由Ikaros基因的第8外顯子編碼, 而Ikaros-4、Ikaros-5和Ikaros-6編碼的蛋白質異形體(Ik4、Ik5和Ik6)由于第4外顯子的缺失而只獲得了5個保守的ZnFs, 其中N端有3個, C端有2個(圖2)。使用SWISS-MODEL工具對Ikaros蛋白序列進行同源建模, 同源性分析發現在含有ZnFs的序列中有相似的同源蛋白, 其中含有N端4個ZnFs的序列(位于Ikaros氨基酸序列的第205—340位置)與小鼠Zfp29基因編碼的Aart[PDB code: 2i13A]同源性較高, 為41.38%, 而含有C端2個ZnFs的序列(位于Ikaros氨基酸序列的第554—619位置)與人ZBTB43基因編碼的Zinc finger protein 297B [PDB code:2cshA]同源性較高, 為33.33%。通過Alignment mode進行人工聯配, 構建Ikaros的三維空間結構, 結果如圖3所示。Ikaros蛋白N端的4個ZnFs由4個α螺旋和8個β折疊片組成, C端ZnFs由2個α螺旋和4個β折疊片組成, 其中在每個α螺旋和2股反向平行的β折疊片之間均含有1個鋅離子, 在鋅離子的結合下, 這三個肽段可緊密折疊形成一種具有“手指”形狀的ββα結構, 即鋅指結構。

表 2 尼羅羅非魚Ikaros基因的序列組分及其蛋白質的理化性質Tab. 2 The sequence component and protein physicochemical properties of Ikaros gene from O. niloticus

圖1 尼羅羅非魚Ikaros基因結構模式圖Fig. 1 The Ikaros gene structures of O. niloticus

2.4 尼羅羅非魚Ikaros的系統進化分析

將尼羅羅非魚Ikaros-1編碼的氨基酸序列與大黃魚(Larimichthys crocea)、日本青鳉(Oryzias latipes)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、大西洋鮭(Salmo salar)、鯉(Cyprinus carpio)、斑點叉尾鲙(Ictalurus punctatus)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)、雞(Gallus gallus)、小鼠、牛(Bos taurus)和人的Ikaros氨基酸序列進行同源比對, 其同源性分別為93.7%、93.2%、89.6%、87.0%、79.0%、74.0%、70.6%、63.4%、67.0%、64.3%、60.7%和64.0%。對上述物種的Ikaros蛋白結構域分析發現, 尼羅羅非魚與其他魚類、哺乳類和兩棲類一樣, 均具有6個典型的ZnFs, 且不同物種的ZnFs高度保守, 僅有個別氨基酸存在差異。利用MEGA5.05軟件對尼羅羅非魚Ikaros6種mRNA剪接異構體編碼的氨基酸序列與其他23個不同物種的Ikaros氨基酸序列按鄰接法(Neighbor-joining)構建系統發育樹(圖4)。從圖中可以看出, 硬骨魚類的Ikaros聚為一簇, 其中尼羅羅非魚與其他慈鯛科魚類親緣關系最近, 其次是鱸形目、鲀形目、鳉形目魚類。兩棲類、鳥類、哺乳類動物Ikaros聚為另一簇。軟骨魚類鰩(Raja eglanteria)和無頜類七鰓鰻(Lampetra japonicum)的Ikaros與上述物種的親緣關系較遠, 分別單獨聚為一支。

圖2 尼羅羅非魚Ikaros蛋白保守結構域預測Fig. 2 Prediction of conserved domain in Ikaros protein of O. niloticus

圖3 尼羅羅非魚Ikaros鋅指結構域空間結構模擬Fig. 3 The predicted three-dimensional space structure of Ikaros ZnFs from O. niloticus

圖4 基于不同物種Ikaros氨基酸序列構建的系統進化樹(NJ法)Fig. 4 Phylogenetic tree of Ikaros in different species based on NJ method

圖5 Ikaros基因在尼羅羅非魚不同組織中的表達Fig. 5 Relative expression of Ikaros gene in different tissues of O. niloticus

2.5 Ikaros基因在健康尼羅羅非魚不同組織中的表達特征

采用實時熒光定量PCR對Ikaros基因在健康尼羅羅非魚不同組織中的表達進行分析。結果顯示,Ikaros基因在被檢測的血液、胸腺和脾臟等11個組織中均有表達(圖5)。其中血液和胸腺的表達量最高, 均顯著高于其他組織器官, 脾臟和頭腎也有較高的表達水平, 而在鰓、心臟、腦、腸、肌肉、皮膚和肝臟的表達水平較低。

2.6 感染無乳鏈球菌后Ikaros基因在尼羅羅非魚組織中的表達變化情況

應用實時熒光定量PCR檢測實驗組和對照組的尼羅羅非魚血液、胸腺、頭腎、脾臟組織中Ikaros基因的表達。與對照組相比, 感染無乳鏈球菌后血液、胸腺、頭腎、脾臟組織中Ikaros基因均上調表達, 且其表達特征相似, 均在48h達到峰值并顯著高于對照組(P＜0.01)(圖6)。

3 討論

3.1 尼羅羅非魚Ikaros基因序列特征及分析

本實驗獲得了尼羅羅非魚IkaroscDNA及基因組DNA的全長序列, 發現該基因有8個外顯子和7個內含子, 且連接處均符合GT-AG規律, 其中第4外顯子和第7外顯子存在跳躍現象, 即在mRNA剪接過程中這2個外顯子可能會被剪接或者被保留, 而第6內含子在3′末端存在2個相鄰的剪切信號(AGTAG),這可能會造成第7外顯子在剪接過程發生剪切位點偏移的現象(圖1)。Hoskins等[12]研究表明, 外顯子內部的剪接增強子(Exon splicing enhancer, ESE)與在RNA剪接中起調控作用的SR蛋白的作用模式可能是出現外顯子跳躍現象的主要原因, 當ESE序列發生突變時, ESE將不能與SR蛋白結合, 導致該外顯子在剪接過程中被跳過。而關于剪切位點偏移現象的發生是隨機的還是受相關分子的調控以及它在調節基因表達過程中是否具有特別的生理意義目前還不清楚。

Ikaros基因的可變剪接現象普遍存在于脊椎動物中, 而且它們的可變剪接方式基本相同[13—20], 但不同物種IkarosmRNA剪接異構體的數量卻不盡相同, 目前已發現在人類[8]中有13種, 斑馬魚[19](Danio rerio)有6種, 虹鱒[16](Oncorhynchus mykiss)有4種, 本研究在尼羅羅非魚中發現了6種。可變剪接極大地增加了真核生物基因表達的復雜程度和蛋白質功能的多樣性, 其普遍存在于脊椎動物中, 在多外顯子人類基因中的比例更是高達92%—94%[21]。因此,Ikaros基因的多種mRNA剪接異構體也暗示著該基因在功能上的多樣性。在人類中, Ik1和Ik2參與造血干細胞的早期發生和發育, 并能有效抑制癌細胞和腫瘤的發生; Ik4、Ik6、Ik7和Ik8是一種顯性負亞型, 其異常表達與急性淋巴細胞白血病的發生和發展密切相關; 而關于其他蛋白質異形體的功能目前還不清楚, 有待進一步研究[8,22,23]。

圖6 無乳鏈球菌感染后Ikaros基因在尼羅羅非魚胸腺、頭腎、脾臟及血液中的表達情況Fig. 6 Expression profile of Ikaros gene in the thymus, head kidney, spleen and blood of O. niloticus after infection with Streptococcus agalactiae

3.2 尼羅羅非魚Ikaros同源比較及結構域分析

Ikaros廣泛存在于各類脊椎動物中, 它們均具有4個N端ZnFs和2個C端ZnFs, 而且不同物種之間的ZnFs在氨基酸序列上僅有幾個氨基酸殘基不同,表明Ikaros的ZnFs在結構和功能上具有高度的保守性。但由于編碼N端ZnFs的外顯子在可變剪接過程中不同程度缺失, 因此不同Ikaros蛋白質異形體的N端ZnFs數量不盡相同, 該現象普遍存在于各物種中[13—20]。研究表明, N端ZnFs數量在3個及以上的Ikaros蛋白質異形體可與目標基因的核心啟動子區域以高親和力結合, 發揮轉錄調節作用; N端Zn-Fs數量少于3個的Ikaros蛋白質異形體則不能與DNA結合, 而是通過顯性負調控的方法抑制Ikaros的功能[24,25]。然而, 尼羅羅非魚6個Ikaros蛋白質異形體的N端ZnFs數量均在3個以上, 表明它們均是具有DNA結合能力和轉錄活性的轉錄因子。C端的ZnFs相對保守, 存在于所有Ikaros蛋白質異形體和家族其他成員中。研究表明, Ikaros同源蛋白之間可通過C端ZnFs的相互作用形成同源或異源二聚體, 而這些不同組合的二聚體實質上代表的是一個復雜的轉錄因子調控網絡, 對Ikaros家族蛋白的DNA結合活性及轉錄調控方面均具有重要的作用[26,27]。Ikaros作為許多信號通路的關鍵轉錄因子,其N端ZnFs和C端ZnFs在信號通路的調控中發揮了重要作用。研究表明, 當小鼠敲除Ikaros基因編碼C端兩個ZnFs的序列時, 淋巴系統的發育表現異常,造血干細胞的活性嚴重抑制, T、B淋巴細胞也沒有產生[28]; 當敲除小鼠Ikaros基因編碼N端兩個Zn-Fs的序列時, 發現成熟T細胞和NK細胞的發育被抑制, 導致腫瘤的產生[3,29]。

3.3 尼羅羅非魚Ikaros基因的表達特征

為了揭示Ikaros基因在尼羅羅非魚各組織中的表達情況, 本研究利用實時熒光定量PCR對Ikaros6種mRNA剪接異構體的總表達量進行了檢測, 結果表明Ikaros基因在尼羅羅非魚11個被檢測的組織中均有表達(圖5), 其中在血液中的表達量最高, 其次為胸腺、脾臟和頭腎, 在其他組織中的表達量較低。Ikaros基因在其他魚類和無頜類中均具有廣泛的組織表達模式, 但在不同組織的表達水平卻表現出一定的差異, 如斑馬魚[19]Ikaros基因在胸腺和前腎組織中具有較高的表達水平, 在中腎、脾、心臟、腸、大腦以及精巢中均檢測到了不同程度的表達; 半滑舌鰨[20]Ikaros基因在胸腺、脾以及肝臟中表達量較高, 在腎臟、精巢和心臟中也有一定量的表達, 而在腸、皮膚以及鰓中表達量很低; 七鰓鰻[18](Lampetra japonicum)Ikaros基因在精巢和卵巢中表達量最高, 其次是腎臟、腸、肝臟、鰓和血液。在哺乳動物人類和小鼠中,Ikaros基因主要表達于造血干細胞、所有的淋巴細胞及部分髓系細胞中, 因此在含有大量造血干細胞和淋巴細胞的血液、胸腺等免疫組織或器官中具有較高的Ikaros表達量[2]。上述研究顯示,Ikaros基因在不同物種中的表達模式雖不盡相同, 但其在胸腺、頭腎、脾臟等主要免疫器官中高表達, 反映了該基因具有重要的免疫功能。

目前, 有關魚類Ikaros在免疫應答中作用的研究較少, 僅在半滑舌鰨[20]中開展了免疫LPS和LTA后的Ikaros應答研究, 結果顯示在經過LPS或LTA處理的頭腎巨噬細胞中,Ikaros基因的表達量顯著上調。這表明Ikaros在巨噬細胞中具有特異性表達, 為重要的免疫相關因子, 受病原相關分子模式調控。本研究發現, 尼羅羅非魚在人工感染無乳鏈球菌后, 血液、胸腺、頭腎和脾臟中Ikaros基因的相對表達量均顯著上調, 并在48h達到峰值。因此, 推測尼羅羅非魚Ikaros參與了調控魚體抵御外界病原微生物的免疫應答反應, 是一種重要的免疫轉錄調控因子。

有研究表明, 不同Ikaros蛋白質異形體在表達模式上可能存在一定差異, Molnár等[30]發現小鼠的Ik1和Ik2在淋巴細胞的發育過程中表達量最高,Ik4僅在淋巴樣祖細胞中表達, 而其他的蛋白質異形體在淋巴細胞分化的不同階段的表達量均不高。但是Willett等[19]在斑馬魚中卻發現4種主要的Ikaros蛋白質異形體在各組織中的相對表達量相似,Hansen等[16]在虹鱒中也發現了4種Ikaros蛋白質異形體, 而且它們在胸腺、前腎和脾臟組織中均有相似的表達。關于魚類的不同Ikaros蛋白質異形體在表達模式上是否表現為一致目前尚無足夠證據證明, 應在多種魚類中對該研究內容進行深入研究。因此作者欲揭示尼羅羅非魚各種Ikaros蛋白質異形體的功能以及表達模式, 可從原位雜交、免疫組化和細胞培養等研究中入手, 這也將是下一步Ikaros研究中的重點內容。

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