赤水河半鰒的遺傳多樣性和種群歷史動態(tài)分析

李文靜 王環(huán)珊 劉煥章 曹文宣 王小明 于 江 朱 昕

(1. 中國科學院水生生物研究所水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049;3. 中國三峽建設管理有限公司, 成都 610041)

赤水河有著美酒河、生態(tài)河、英雄河的美稱,是長江上游唯一一條干流未建水壩, 且與長江保持連通的大型一級支流[1]。赤水河作為長江上游珍稀、特有魚類國家級自然保護區(qū)的重要組成部分,是一個與保護區(qū)既相聯(lián)系又相對獨立的系統(tǒng)。根據(jù)中國科學院水生生物研究所的監(jiān)測, 半鰐在赤水河有一定的種群數(shù)量, 因此具有著重要的保護價值。

半鰐Hemiculterella sauvagei隸屬于鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae鲌亞科Cultrinae半鰐屬Hemiculterella, 地方名稱藍片子、鰐條、藍刀皮[1,2]。半鰐是長江上游特有魚類, 在長江上游干流、沱江、岷江、嘉陵江、青衣江和大渡河等水系有分布[2,3]。近年來, 由于水利工程建設、酷漁濫捕等人為條件的影響, 其野生資源已受到嚴重威脅。目前, 關(guān)于半鰐的研究主要涉及其地理分布[4]、年齡和生長[1]、繁殖生物學[5]、寄生蟲[6]、物種保護[7]以及線粒體全基因組序列的測定[8], 但有關(guān)半鰐的遺傳多樣性及種群歷史動態(tài)的工作尚未得到充分開展。遺傳多樣性不僅是生物多樣性的核心部分, 也是生命進化和物種分化的基礎, 更是評價自然生物資源的重要依據(jù)[9]。

線粒體DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)具有相對較高的進化速率, 目前已廣泛應用于各種動物類群的系統(tǒng)發(fā)育和種群遺傳多樣性研究[10]。Cytb基因是一段編碼蛋白質(zhì)的DNA序列, 已有的研究表明在鯉形目魚類的物種及種以下階元中, 其進化速率明顯高于控制區(qū)基因[11], 因而在鯉形目魚類種群的遺傳多樣性和歷史動態(tài)研究中比控制區(qū)更加合適[12—16]。

本研究選取赤水河水潦、茅臺、赤水市、二合及太平5個不同地理種群的168尾半鰐為實驗對象, 對其Cytb基因序列進行擴增并測序, 期望通過研究半鰐種群的遺傳多樣性, 對赤水河半鰐資源現(xiàn)狀進行評估, 從而為半鰐資源的保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

半鰐樣本采自赤水河5個地點(水潦、茅臺鎮(zhèn)、赤水市、二合鎮(zhèn)、太平鎮(zhèn)), 采樣地點、樣本數(shù)量見圖1和表 1。從每尾新鮮樣本背鰭以下、側(cè)線以上的右側(cè)取2—3 g肌肉, 以95% 的酒精固定于離心管中帶回實驗室, 樣本儲存于4℃的冰箱中。另外,在GenBank中下載鰐(Hemiculter leucisculus)(登錄號為AY089716)和蒙古鲌(Culter mongolicus)(登錄號為AP009060)的Cytb序列作為外類群。

1.2 基因組DNA的提取以及PCR擴增

本研究采用改進的高鹽法提取基因組DNA[17],并采用以下引物來擴增Cytb基因序列: L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′和H15915(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[18]。

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)的反應總體積為30 μL: 10×buffer 3.0 μL,dNTP (2.5 mmol/L)1.5 μL,Taq聚合酶0.25 μL, 模板DNA 3 μL, 正反向引物各1 μL, ddH2O 20.25 μL。PCR反應程序為: 94℃變性4min, 接著是35個循環(huán),每個循環(huán)包括: 94℃變性45s, 56℃退火45s, 72℃延伸1min, 然后72℃延伸10min, 最后10℃保存10min。

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增的產(chǎn)物進行檢測, 挑選其中有目的條帶, 且條帶清晰的產(chǎn)物送生物公司進行純化及測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Clustal X[19]和Seaview[20]對測序結(jié)果進行序列編輯、校對和排序。

圖1 赤水河流域半鰐采樣點(●代表采樣點的位置)Fig. 1 Sampling sites of Hemiculterella sauvagei in Chishui River (●indicates sampling site)

表 1 基于線粒體Cyt b基因的赤水河半鰒各地理種群遺傳多樣性Tab. 1 Genetic diversity in five populations of Hemiculterella sauvagei in the Chishui River based on mtDNA Cyt b gene

使用DnaSP 5.0軟件[21]計算單倍型數(shù)目(Num-ber of haplotypes)、多態(tài)位點數(shù)目(Number of polymorphic sites)、單倍型多樣性(Haplotype diversity)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)、變異位點(Variable sites)、單一突變位點(Singleton sites)、簡約信息位點(Parsimony-informative sites)等。

使用Mega 6.0軟件[22,23]計算序列的堿基組成、種群間的凈遺傳距離, 采用鄰接法(Neighborjoining, NJ)[24]以鰐和蒙古鲌為外類群, 構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Network軟件, 以中接法(Medianjoining)構(gòu)建單倍型的網(wǎng)絡關(guān)系圖, 檢測各個單倍型間的進化關(guān)系。

使用Arlequin 3.11軟件[25]統(tǒng)計遺傳分化水平,采用分子變異分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA)檢測遺傳變異來源, 估算種群遺傳結(jié)構(gòu)和地理種群遺傳變異的分布。用種群差異的精確性檢驗(Exact tests of population differentiation)[26]來估計2個種群的分化水平指數(shù)Fst, 并采用Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗以及核苷酸不配對分布(Mismatch distribution)來檢測種群歷史動態(tài)。通過粗糙指數(shù)(Harpending’s Raggedness index, Hri)[27]來檢測核苷酸不配對分布與種群擴張模型下期望分布之間的擬合優(yōu)度。對于不能拒絕種群擴張模型而且錯配分布呈現(xiàn)光滑單峰的種群, 用公式τ=2ut估算種群擴張時間[28], τ為Tau, 是種群擴張參數(shù), t為每個世代種群的擴張時間, u為每個世代每條序列的變異速率; 另根據(jù)u=2μk計算u, μ為每個堿基的變異速率, k表示序列長度(bp)。 擴張時間T=t×世代時間,T值由Arelequin軟件計算得到, 突變率μ參照前人研究[29], 采用1% per Myr (1×108)。

2 結(jié)果

2.1 赤水河半鰒的序列變異和單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

本研究得到了168條半鰐線粒體Cyt b基因序列, 比對后得到序列長度為1137 bp。序列中無堿基的插入和缺失。在168條序列中, 共有42個變異位點, 占總位點數(shù)的3.69%, 其中單突變位點有13個,占總位點數(shù)的1.14%, 簡約信息位點有29個, 占總位點數(shù)的2.55%。

168個樣本的平均堿基組成: A=27.5%, T=27.3%, C=29.1%, G=16.0%。A+T的含量為54.8%,C+G的含量為45.1%, A+T含量高于C+G的含量。G的含量最低, 堿基組成表現(xiàn)出了明顯的偏倚, 這恰好符合脊椎動物線粒體DNA基因的共同特性。5個種群總體的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為0.895±0.012和0.00487±0.00695, 表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性。

168條序列共檢測到38種單倍型(表 1)。其中,水潦種群22條序列檢測到12個單倍型, 茅臺鎮(zhèn)種群45條序列檢測到11個單倍型, 赤水市種群40條序列檢測到25個單倍型, 二合鎮(zhèn)種群39條序列檢測到9個單倍型, 太平鎮(zhèn)種群22條序列檢測到10個單倍型。在所檢測到的38個單倍型中, 單倍型Hap1、Hap2和Hap6的分布最廣, 為全部種群所共享。其中有24個單倍型為某一個種群所獨有, 其余11個單倍型則被2—4個種群共享。

圖2 基于Cyt b序列構(gòu)建的半鰐單倍型NJ樹Fig. 2 Phylogenetic tree of haplotypes by NJ analysis based on Cyt b sequences

以鰐和蒙古鲌為外類群, 利用鄰接法(Neighbor joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood,ML)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示兩種方法做出的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)一樣, 以NJ樹為例(圖2)。38個單倍型大致可以分為5個譜系, 其中譜系1由Hap9、Hap33、Hap37等12個單倍型組成; 譜系2由Hap15、Hap13、Hap14、Hap21、Hap24, 5個單倍型組成; 譜系3由Hap18、Hap38、Hap17、Hap8、Hap32, 5個單倍型組成; 譜系4由Hap22、Hap6、Hap35等12個單倍型組成; 譜系5則由Hap23、Hap29、Hap12、Hap34, 4個單倍型組成?？梢钥吹? 同一地點的單倍型沒有聚為單系, 而是分散在不同的譜系中, 說明還沒有出現(xiàn)種群的譜系分化。

利用Network軟件, 以中接法構(gòu)建的半鰐各單倍型進化網(wǎng)絡圖(圖3), 結(jié)果表明: Hap1、Hap2、Hap6是5個地理種群的共享單倍型, Hap4是4個地理種群的共享單倍型。該單倍型關(guān)系圖與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致, 各單倍型相互散布在不同的地理種群中, 未形成明顯的系統(tǒng)地理格局。

2.2 赤水河半鰒種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群分化

種群遺傳多樣性和遺傳距離從遺傳多樣性指數(shù)來看, 在這5個種群中, 赤水市的單倍型多樣性最高, 為0.922±0.032, 茅臺鎮(zhèn)的單倍型多樣性最低, 為0.842±0.032; 水潦的核苷酸多樣性最高, 為0.00495±0.00434, 茅臺鎮(zhèn)的核苷酸多樣性最低, 為0.00386±0.00342 (表 1)。

種群遺傳結(jié)構(gòu)和分化運用Arlequin 3.11軟件進行種群間遺傳分化(Fst)分析(表 2), 結(jié)果表明:赤水市種群與茅臺鎮(zhèn)種群、二合鎮(zhèn)種群、水潦種群之間存在高度分化(Fst＞0.15), 且差異很顯著(P=0.0000,P＜0.01), 赤水市種群與太平鎮(zhèn)種群之間有中度遺傳分化(Fst=0.11692, 0.05＜Fst＜0.15), 差異也很顯著(P=0.0000,P＜0.01)。除赤水市種群外, 其他4個種群之間均未出現(xiàn)分化(Fst＜0.05)。

采用Mega 6.0 軟件計算5個種群的遺傳距離,5個種群之間的平均凈遺傳距離范圍為0.004—0.006(表 3): 水潦種群和茅臺鎮(zhèn)種群之間的遺傳距離為0.004, 水潦種群和二合鎮(zhèn)種群之間的遺傳距離為0.005, 水潦種群和太平鎮(zhèn)種群之間的遺傳距離為0.005, 水潦種群和赤水市種群之間的遺傳距離為0.006, 茅臺鎮(zhèn)種群和二合鎮(zhèn)種群之間的遺傳距離為0.004, 茅臺鎮(zhèn)種群和太平鎮(zhèn)種群之間的遺傳距離為0.004, 茅臺鎮(zhèn)種群與赤水市種群之間的遺傳距離為0.006, 二合鎮(zhèn)種群和太平鎮(zhèn)種群之間的遺傳距離為0.005, 二合鎮(zhèn)種群與赤水市種群之間的遺傳距離為0.006, 太平鎮(zhèn)種群和赤水市種群之間的距離為0.005。

將5個地理種群兩組, 水潦、茅臺鎮(zhèn)、二合鎮(zhèn)和太平鎮(zhèn)為一組, 赤水市一組, 然后采用Arlequin 3.11軟件進行分子方差分析(AMOVA)(表 4), 結(jié)果顯示: 赤水河半鰐種群內(nèi)存在較高的遺傳變異(80.95%), 而組間變異占種群遺傳變異的19.82%,組內(nèi)種群間的變異占-0.77%, 由此可見, 赤水河半鰐的遺傳變異主要來源于種群內(nèi)部, 且在P=0.01水平上顯著, 5個地理種群之間存在基因交流。

2.3 種群擴張及分化時間

使用Arlequin3.11軟件對5個種群所有的168個半鰐個體進行Tajima’sD檢驗和Fu’sFs檢驗, 以及種群擴張時間的估算(表 5)。結(jié)果表明: Tajima’sD檢驗只有赤水市種群為負值, 但并未達到顯著性水平(P=0.12100,P＞0.05)。在Fu’sFs檢驗中, 水潦種群、赤水市種群和太平鎮(zhèn)種群的Fs值均為負, 但只有赤水市種群達到顯著性水平(P=0.00000,P＜0.01)。以上結(jié)果表明, 水潦、太平鎮(zhèn)和赤水市種群經(jīng)歷了種群擴張。采用1% per Myr的突變速率, 本研究推算出半鰐水潦種群、太平鎮(zhèn)種群以及赤水市種群的大約擴張時間分別為0.43、0.40和0.37百萬年前。

圖3 半鰐各單倍型間的進化網(wǎng)絡圖Fig. 3 Statistical parsimony network based on cyt b haplotype frequencies of Hemiculterella sauvagei

表 2 基于Cyt b序列單倍型頻率的半鰒種群成對Fst值(對角線下)和校正P值(對角線上)Tab. 2 F-Statistics (below diagonal)and Corrected P value (above diagonal)from haplotype frequencies of Hemiculterella sauvagei based on Cyt b gene

表 3 半鰒各地理種群間的遺傳距離Tab. 3 The distances among 5 Hemiculterella sauvagei populations

表 4 基于線粒體cyt b基因?qū)Τ嗨影膂v不同地理種群的AMOVA分析Tab. 4 AMOVA analysis for Hemiculterella sauvagei among different populations based on cyt b in the Chishui River

表 5 基于Cyt b基因的半鰒種群中性檢驗及種群擴張時間估算Tab. 5 Statistical tests for neutrality and time of expansion of Hemiculterella sauvagei based on Cyt b gene

3 討論

3.1 半鰒種群遺傳多樣性

生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性, 其中遺傳多樣性是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎, 也是生物多樣性的核心和重要組成部分。核苷酸多樣性(Pi)和單倍型多樣性(Hd)是評價種群遺傳多樣性的重要指標, 其值越大,則種群的遺傳多樣性就越高。本研究中赤水河半鰐的Cytb基因的核苷酸多樣性的范圍為0.386%—0.495%, 與銅魚(Coreius heterodon)(0.25%)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)(0.092%)[30]、刀鱭(Coilia macrognathos)(0.185%—0.373%)[31]等種類相比,核苷酸多樣性相對較高。整個半鰐種群的單倍型多樣性均大于0.5, 核苷酸多樣性均小于0.5%, 故表現(xiàn)出高的Hd值和低的Pi值。

3.2 半鰒地理種群的遺傳分化

同一種魚棲息在不同的環(huán)境中, 會造成魚類基因流的限制或中斷。遺傳分化系數(shù)(Fst)是反映亞群間遺傳分化的重要指標。Wright[32]認為: 若種群Fst為0—0.05, 則表明其各亞群間不存在分化; 若Fst為0.05—0.15, 則表明其各亞群間存在中度分化;若Fst為0.15—0.25, 則為高度分化。在本研究中的5個地理種群中, 赤水市種群和茅臺鎮(zhèn)種群、二合鎮(zhèn)種群、水潦種群之間存在著高度的分化, 而與太平鎮(zhèn)種群之間存在著中度分化。AMOVA結(jié)果表明, 種群內(nèi)變異是遺傳變異的主要來源, 并且存在顯著差異(P＜0.01), 因此, 赤水市與其他4個地理種群之間存在著分化, 缺少基因交流。我們認為造成分化的可能原因是赤水市在地理位置上處于赤水河較下游地區(qū), 而其他4個地方處于上游或中游, 因此他們之間可能存在著地理隔離, 而地理隔離又會造成生殖隔離, 從而造成不同地理種群的半鰐之間發(fā)生分化。

3.3 半鰒種群的歷史動態(tài)

Grant和Bowen[33]提出了一個較簡單的模式, 利用單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)來估計種群的進化歷史, 當Hd≥0.5,Pi＜0.5%時, 是受瓶頸效應后種群數(shù)量的迅速擴張導致; 當Hd≥0.5,Pi≥0.5%時, 表示種群穩(wěn)定, 具有比較悠久的進化歷史;當Hd＜0.5,Pi≥0.5%時, 種群經(jīng)歷了輕微的瓶頸效應, 幾乎沒有影響到核苷酸變異; 當Hd＜0.5,Pi＜0.5%時, 表明種群近期經(jīng)歷了瓶頸效應。本研究中的5個地理種群的單倍型多樣性都較高(Hd≥0.5), 而核苷酸多樣性較低(Pi＜0.5%), 由于核苷酸多樣性所需時間比積累單倍型所需的時間漫長, 這說明本研究中的五個地理種群的半鰐種群是從一個有效種群數(shù)量較小的種群, 經(jīng)快速擴張而來的, 但是仍然沒有達到積累核苷酸變異所需要的時間。整個半鰐種群的單倍型多樣性較高, 而核苷酸多樣性較低,這說明整個半鰐種群都是從較小的種群迅速擴張而來的[33—35]。

推測種群經(jīng)歷過的歷史, 一般要用到Tajima’sD檢驗和Fu’sFs檢驗, Tajima’sD和Fu’sFs呈負值,并且在統(tǒng)計學上有較顯著的標準, 則說明序列中含有比中性進化模型更多的核苷酸位點變化, 可能預示著被研究種群經(jīng)歷過一個擴張的歷史[36,37]。本研究中只有赤水市種群的Tajima’sD值呈負值, 但不顯著偏離中性檢驗(P＞0.5), 水潦、太平鎮(zhèn)、赤水市種群的Fu’sFs值均呈負值, 但只有赤水市種群與中性進化的差異顯著, 說明水潦、太平鎮(zhèn)種群以及赤水市種群在歷史上出現(xiàn)擴張。

3.4 關(guān)于赤水河半鰒的保護

半鰐是長江上游的特有魚類之一, 在赤水河有分布。有文獻記載, 半鰐分布于長江上游的干流,但主要集中在四川的西部[2,3]。但從近幾年的漁獲物調(diào)查中發(fā)現(xiàn), 長江上游已很少有半鰐的蹤跡。近些年赤水河的漁獲物結(jié)果表明, 半鰐在2014—2015年的漁獲物比重相比2014年以前有所下降, 原因可能為酷漁濫捕、水質(zhì)污染、天然繁殖場遭到破壞以及其他環(huán)境條件改變等。

半鰐作為赤水河水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 對維系赤水河以及長江的生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)完整和功能的正常發(fā)揮具有重要的意義。目前赤水河的半鰐資源減少, 對其進行保護刻不容緩。本研究結(jié)果顯示, 赤水市種群與其他4個地理種群存在分化,所以在保護工作中, 應將他們作為兩個不同的管理單元, 采取不同的保護措施進行保護, 應對赤水市種群采取重點保護。另外, 要在半鰐產(chǎn)卵期禁止捕魚, 并對捕撈工具或網(wǎng)目大小做出明確的規(guī)定, 保證半鰐的生殖繁衍和資源恢復。

致謝：

感謝中國科學院水生生物研究所魚類生態(tài)學與資源保護學科組工作人員在采樣上給予幫助, 感謝唐瓊英副研究員、鞏政博士對文章修改提出的寶貴意見！

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