不同餌料對稀有鰉鯽仔稚魚生長、消化道及消化酶的影響

趙月月 趙健蓉 胡佐燦 楊 洋 詹素平 劉小紅 王志堅

(西南大學生命科學學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室 , 水產科學重慶市市級重點實驗室, 重慶 400715)

稀有逗鯽(Gobiocypris rarus)俗名金白娘、墨線魚, 隸屬于鯉形目、鯉科、逗鯽屬, 為我國特有魚類。因具個體小、性成熟早、繁殖期短等特點,已經成為一種新的魚類實驗動物[1]。目前, 稀有逗鯽已經在魚類免疫學、遺傳學、環境科學等領域的研究中得到廣泛應用[2—5]。

消化道是食物消化、吸收的場所, 對魚類的生長發育和繁殖等重要生命活動有直接關系。研究消化道的組織形態結構, 是認識和探討魚類攝食、消化及吸收等生理機制的基礎和途徑之一[6]。仔稚魚期間的餌料對于消化道的發育、魚體的生長均有重要的影響。有學者認為仔稚魚階段幼魚對人工飼料利用能力較差[7], 因此需要在魚類早期發育階段投喂活餌。活餌所提供的外源性消化酶可能對其生長和發育起到不可忽略的作用[8]。在消化系統發育趨于完善的過程中, 消化酶對于營養物質的消化吸收具有關鍵作用, 其活力是反映動物消化生理狀況和對營養物質利用能力的重要指標[9,10]。目前關于稀有逗鯽早期生長發育已有一些研究[11—13],但至今仍缺乏遺傳背景清晰的品種品系和標準化的養殖體系的建立; 本研究用3種不同餌料投喂稀有逗鯽仔稚魚, 通過研究仔稚魚消化道發育程度及消化酶活力, 以更深入了解餌料與消化道發育之間的關系, 從而為標準化養殖提供基礎理論資料。

1 材料與方法

1.1 餌料及試驗魚

商業化微顆粒飼料和豐年蟲(Artemia nauplii)卵分別購買于山東升索漁用飼料研究中心和山東愛家寵物水族用品有限公司, 商業化微顆粒飼料主要營養成分及氨基酸含量檢測數據由北京市營養源研究所分析檢測中心提供, 豐年蟲相關數據參考黃權等[14]的研究結果(表 1、表 2)。

選取由淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室長期人工飼養的稀有逗鯽親本8對[雌魚體質量(0.97±0.17) g, 體全長(42.96±5.84) mm; 雄魚體質量(0.82±0.26) g, 體全長(41.30±7.15) mm]。通過干法授精獲取受精卵, 在室內進行人工孵化, 水溫為(24±1)℃, 光周期為14L鯰10D, 溶氧量大于6.0 mg/L, 氨氮含量小于0.05 mg/L, 水體pH為6.5—7.0。將稀有逗鯽初孵仔魚隨機分為3個組: 活餌組、飼料組、轉食組, 每組3個平行。活餌組投喂方式為: 從3 dah仔魚開始一直投喂豐年蟲; 飼料組投喂方式為: 3—22 dah投喂商業化微顆粒S1飼料(顆粒大小為150—250 μm), 23—35 dah投喂商業化微顆粒S3飼料(顆粒大小為480—750 μm); 轉食組投喂方式為: 3—12 dah仔魚投喂豐年蟲, 13—22 dah混合投喂豐年蟲和微顆粒S1飼料(每天增加10%微顆粒S1飼料, 減少10%豐年蟲), 23 dah以后的仔稚魚投喂S3飼料。1—2 dah因仔魚未開口, 故不投喂。飼養期間每天飽食投喂3次, 投喂時間段為8:00—9:00、12:00—13:00、18:00—19:00, 每次投喂前清除缸內剩余餌料和糞便殘渣。

表 1 微顆粒飼料和豐年蟲的主要營養成分Tab. 1 Main nutrition components of micro-diet and Artemia nauplii (%)

表 2 微顆粒飼料和豐年蟲的氨基酸組成(單位： %)Tab. 2 Amino acid components of micro-diet and Artemia nauplii

1.2 樣品采集

在仔稚魚10、15、20、25、30、35 dah時測量并記錄生長指標, 并于35 dah時收集酶學和組織學材料。每組仔稚魚經MS-222(Sigma, USA)麻醉, 迅速去頭尾, 經液氮速凍后, 置于-80℃超低溫冰箱保存, 用于進一步的消化酶活力測定。每組另取全魚3尾, 波恩氏液(Bouin’s)固定24h后, 于70%酒精中暫存, 用于消化道組織學研究。

1.3 存活率和生長指標測定

用游標卡尺(精度0.01 mm)測量體全長; 用分析天平[奧豪斯AR2130, 奧豪斯國際貿易(上海)有限公司, 精度0. 001 g]測量體質量。根據記錄和測量數據, 計算存活率(Survival rate,SR)、特定生長率(Specific growth rate,SGR)等生長指標。SR和SGR的計算公式如下:

式中Nt為終末尾數,N0為初始尾數,Mt為終末體質量(g),M0為初始體質量(g),T為時間(d)。

1.4 組織學研究

取波恩氏液(Bouin’s)固定后材料, 經梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋, 切片(厚度為5 μm), 蘇木精-伊紅(Haematoxylin-eosin, HE)染色, 中性樹膠封片, 于NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(尼康公司, 日本)觀察、照相, 并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量。不同組別的仔稚魚食道、前、中、后腸各取10張切片并隨機選取10個視野, 分別測量每一視野中100 μm×100 μm范圍內杯狀細胞的總數, 作為杯狀細胞的密度。

1.5 酶液制備和消化酶活力的測定

從-80℃冰箱中取出待測樣品, 置于冰上解凍。解凍后將樣品稱重, 按重量(g)鯰體積(mL)=1鯰4加入預冷的勻漿稀釋液(0.86%的氯化鈉溶液), 勻漿。所得勻漿液用低溫超速離心機(Sigma, USA)4℃, 3000 r/min離心20min, 取上清。BCA法檢測蛋白濃度后, 根據試劑盒(南京建成生物工程公司, 南京)使用說明書的操作步驟, 用全波長酶標儀(Thermo, USA)或紫外分光光度計(UV-2450)檢測各樣品胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活力。

胰蛋白酶活力定義: 在pH 8.0, 37℃條件下, 紫外分光光度計在波長253 nm時測定, 將每毫克組織蛋白質中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003定義為1個酶活力單位。

脂肪酶活力單位定義: 在37℃條件下, 紫外分光光度計在波長420 nm時, 將每克組織蛋白在反應體系中與底物反應1min, 每消耗1 μmol底物定義為1個酶活力單位。

淀粉酶活力單位定義: 在37℃條件下, 紫外分光光度計在波長660 nm時測定, 將組織中每毫克蛋白與底物作用30min, 水解10 mg淀粉定義為1個酶活力單位。

1.6 數據處理與統計分析

數據均以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。用SPSS17.0統計分析軟件進行分析。體全長、體質量采用雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)以及Duncan氏多重比較,P＜0.05定為差異顯著。存活率、特定生長率及組織形態指數采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)及Duncan氏多重比較,P＜0.05定為差異顯著。

2 結果

2.1 不同餌料對稀有鰉鯽仔稚魚生長和存活率的影響

用3種不同餌料投喂后, 各組實驗魚在15、25和30 dah時的體全長均有顯著性差異(P＜0.05),表現為活餌組最大, 飼料組最小; 在10、20和35 dah時, 表現為活餌組和轉食組體全長顯著高于飼料組(P＜0.05)。在15、25、30和35 dah時, 3組之間體質量也有顯著性差異(P＜0.05), 表現為活餌組最大, 飼料組最小。在10和20 dah時, 活餌組與轉食組體質量無顯著性差異(P＞0.05), 均顯著高于飼料組(P＜0.05)(圖1)。經雙因素方差分析, 日齡和投喂方式均對體質量和體全長的影響達到顯著水平(P＜0.05), 且存在交互作用(P＜0.05)(表 3)。

在35 dah時, 各組仔稚魚的特定生長率有顯著性差異(P＜0.05), 表現為活餌組最高, 飼料組最低。活餌組與轉食組仔稚魚的存活率無顯著性差異(P＞0.05), 均顯著高于飼料組(P＜0.05)(圖2)。

2.2 不同餌料對稀有鰉鯽仔稚魚消化道結構的影響

35 dah稀有逗鯽仔稚魚消化道由口咽腔、食道、前腸、中腸、后腸組成。消化道組織形態指數見表 4。

口咽腔口腔壁由黏膜層、黏膜下層、肌層組成。黏膜層由扁平上皮細胞、杯狀細胞、味蕾等組成, 為復層扁平上皮。杯狀細胞基本分布于黏膜層表層, 為梨形或橢圓形。味蕾呈不規則卵形或瓶形, 由長梭狀細胞和圓錐形細胞組成, 頂端開口于口咽腔。黏膜下層由致密結締組織構成, 與基膜層分界不明顯。肌層發達, 由橫紋肌組成(圖版Ⅰ-a—c)。

食道食道由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜組成。黏膜層向管腔內凸出形成高低、大小不同的黏膜褶皺。黏膜上皮由復層扁平上皮細胞組成, 其表層主要由扁平上皮細胞和杯狀細胞組成。杯狀細胞呈梨形或橢圓形。黏膜下層由疏松結締組織組成, 其間散布有橫紋肌纖維束。肌層縱肌、環肌分界不明顯。漿膜層極薄, 基本不可見(圖版Ⅰ-d—f)。3組黏膜褶皺高度間無顯著性差異(P＞0.05)。肌層厚度3組間有顯著性差異(P＜0.05),活餌組最高, 飼料組最低。黏膜下層厚活餌組顯著高于轉食組(P＜0.05)。活餌組杯狀細胞數目顯著高于轉食組(P＜0.05)。

圖1 稀有逗鯽仔稚魚體全長和體質量(N=15)Fig. 1 Total body length and body mass of larva and juvenile G.Rarus

表 3 日齡和投喂方式對稀有鰉鯽仔稚魚體質量及體全長的影響Tab. 3 Effects of age in days and feeding ways on the total body length and body mass of larva and juvenile G. Rarus

前腸腸道基本與食道相同, 均由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜組成。黏膜層主要由柱狀上皮細胞和杯狀細胞組成, 黏膜層向管腔內折疊形成黏膜褶皺。杯狀細胞基本分布在表層。黏膜下層由疏松結締組織、淋巴管和血管組成。肌層由縱肌、環肌組成, 但分界不明顯(圖版Ⅰ-g—i)。活餌組黏膜褶皺高度和肌層厚度顯著高于飼料組(P＜0.05)。三組間黏膜下層厚有顯著性差異(P＜0.05), 轉食組最高, 飼料組最低。活餌組杯狀細胞數目顯著高于飼料組和轉食組(P＜0.05), 飼料組杯狀細胞數目最少。

中腸中腸組織學結構與前腸基本相同, 均由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜組成(圖版Ⅰ-j—l)。飼料組黏膜褶皺高度和肌層厚均顯著低于活餌組和轉食組(P＜0.05), 活餌組黏膜褶皺和肌層厚均最高, 飼料組黏膜褶皺和肌層厚均最低。活餌組黏膜下層厚度顯著高于飼料組和轉食組(P＜0.05)。三組間杯狀細胞數目有顯著性差異(P＜0.05), 活餌組最多, 飼料組最低。

圖2 稀有逗鯽仔稚魚存活率、特定生長率Fig. 2 Survival rate and specific growth rate of larva and juvenile G. Rarus

表 4 稀有鰉鯽仔稚魚消化道組織形態指數Tab. 4 Morphometrical parameters in digestive tract of larva and G. Rarus

后腸后腸組織學結構與中腸基本相同, 均由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜組成(圖版Ⅰ-m—o)。飼料組黏膜褶皺高度顯著低于活餌組和轉食組(P＜0.05), 活餌組最高。三組間肌層厚度有顯著性差異(P＜0.05), 表現為活餌組最高, 飼料組最低。活餌組黏膜下層厚顯著高于飼料組和轉食組(P＜0.05), 飼料組最低。三組間杯狀細胞數目有顯著性差異(P＜0.05), 表現為活餌組最多, 飼料組最少。

2.3 不同餌料對稀有鰉鯽仔稚魚消化酶活力的影響

實驗魚投喂至35 dah時, 三組間淀粉酶和脂肪酶比活力無顯著性差異(P＞0.05); 活餌組和飼料組的胰蛋白酶比活力無顯著性差異(P＞0.05), 均顯著低于轉食組(P＜0.05)(圖3)。

圖3 稀有逗鯽仔稚魚消化酶活力Fig. 3 Activities of digestive enzymes of larva and G. rarus

3 討論

3.1 不同餌料對稀有鰉鯽仔稚魚存活率和生長的影響

一般認為, 仔魚初次攝食外源性食物的時間、餌料種類、餌料大小、餌料密度等, 對仔魚生長和存活起重要作用[15]。已有學者[16,17]使用與本研究相同的商業化飼料分別對大鱗副泥鰍和胭脂魚仔稚魚的生長發育進行研究, 前期均用豐年蟲開口后轉該飼料, 取得了較好的實驗結果。這說明該商業化飼料基本能夠滿足魚類正常生長發育營養需求,本研究中飼料組出現的負面作用不是因為營養需求達不到引起的。可能是因為稀有逗鯽初孵仔魚偏小, 該飼料不是其良好的開口餌料所致。在稀有逗鯽仔稚魚15 dah時, 從體全長和體質量上看, 已表現出活餌優于飼料和轉食投喂, 此后基本保持這種趨勢。在仔稚魚35 dah時, 活餌組和轉食組的存活率、特定生長率、體全長和體質量均顯著高于飼料組, 表明在稀有逗鯽仔稚魚時期, 用活餌作為開口餌料優于單一投喂飼料, 這與李芹等[9]以瓦氏黃顙魚稚魚為實驗對象的研究結果一致。主動捕食的魚類一般傾向于攝食運動著的餌料, 不喜歡攝食靜止的餌料[18], 而本研究的實驗對象為稀有逗鯽, 是一種捕食性魚類[19]。實驗所用飼料投入水中后, 隨著時間推移, 飼料在水中會逐漸下沉, 而沉在底部的餌料仔稚魚很少攝食, 這可能是造成單一投喂飼料的稀有逗鯽生長性能和存活率明顯劣于投喂活餌和轉食飼養的重要原因。另外, 從人工飼料和豐年蟲一般營養成分含量可以看出, 豐年蟲中粗蛋白質含量多于飼料, 而蛋白質對動物的生長發育有重要意義。這可能是造成一直投喂活餌的實驗魚生長性能表現優于另外兩種投喂方式的原因。同時, 活餌組實驗魚具有最高的存活率和特定生長率, 也提示其具有更好的消化和吸收功能。

3.2 不同餌料對稀有鰉鯽消化道組織形態指數的影響

為了探討活餌是否能促進稀有逗鯽仔稚魚具有功能更強的消化道, 我們觀察了分別投喂活餌、飼料和轉食至35 dah實驗魚的消化道結構。

關于稀有逗鯽成魚消化道的形態學、組織學已有較為詳細的研究[20]。本研究發現, 稚魚消化道結構與成魚類似, 從前向后依次為口咽腔、食道、前腸、中腸、后腸。

稀有逗鯽食道黏膜層向管腔凸起形成縱形褶皺, 這些褶皺在食物通過時會變小或消失, 利于食物的通過。黏膜上層為復層扁平上皮, 有黏液細胞存在, 其中杯狀細胞分泌的黏液可以潤滑食物, 便于吞咽, 且可減少對食道的機械損傷[21]。肌層中環肌縱肌分界不明顯, 但較為發達, 有利于其推動食物進入腸中消化。稀有逗鯽腸結構與食道類似, 均由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層構成[20]。腸內有褶皺, 褶皺可大大增加食糜在腸內停留的時間,促使消化液與食糜充分接觸, 同時增加腸腔的表面積, 增大腸黏膜與食糜的接觸面積, 提高營養的吸收效率[22,23]。可以認為腸內褶皺的高低與魚類消化和吸收能力強弱有一定關系。腸內杯狀細胞主要分泌黏蛋白和消化酶, 在前、中腸起著保護上皮細胞和消化食物的作用, 在后腸則潤滑食物殘渣,利于排出[21]。

在本研究中, 活餌組稀有逗鯽仔稚魚食道、前腸、中腸和后腸的肌層厚度、杯狀細胞數目均顯著高于飼料組。食道的肌層較為發達、杯狀細胞較多, 更便于吞咽、減少機械損傷。前腸和中腸主要起消化和吸收營養物質的作用, 其消化吸收營養物質的能力與杯狀細胞數目有一定關系。后腸杯狀細胞多, 分泌更多的黏蛋白, 利于食物殘渣的排出。提示活餌組實驗魚消化道的發育程度更好, 具有更強的消化吸收功能。

3.3 不同餌料對稀有鰉鯽仔稚魚消化酶活性的影響

餌料的營養成分構成魚體消化酶的底物, 是引起消化酶種類、分布、分泌、活性發生變化的重要因素, 魚類具有適應于不同的餌料而調整消化酶分泌的能力[24,25]。

有研究表明, 魚類消化酶活性與餌料的成分密切相關, 如餌料中的碳水化合物的含量可誘導魚類的淀粉酶活性的升高, 并且投喂人工餌料可以在一定程度上改變消化酶的分泌量[26,27]。關于飼料對淀粉酶活性的作用, 目前的結果尚不一致, 并缺乏深入的機理研究。對真鯛(Pagrosomus major)稚魚的研究發現, 人工配合飼料可以促進實驗魚淀粉酶活性升高, 并且作者認為這種升高現象是食物誘導所致[28]。而飼料對史氏鱘(Acipenser schrencki)仔魚的淀粉酶在消化中的影響并不明顯[29]。在本研究中, 活餌、飼料或者轉食對稀有逗鯽仔稚魚淀粉酶活性均無明顯影響, 與史氏鱘的研究結果相似, 這可能與魚類遺傳特異性有關[27], 具體原因還需深入研究。

目前關于餌料與脂肪酶活性關系的報道較多,但相關結果的結論也不一致。脂肪酶的活性是被三酸甘油酯所激活的, 它的活力與魚類對餌料中脂肪的消化有關[30]。有學者認為脂肪酶的活性與餌料中脂肪含量有關。研究表明, 瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)稚魚脂肪酶活性與餌料中的脂肪含量呈正相關關系[9], 表現出脂肪含量低的活餌組的脂肪酶活性顯著低于脂肪含量高的飼料組。但相反的現象也存在, 如投喂脂肪含量高的餌料后, 真鯛脂肪酶活力反而會下降[28]。甚至也有學者認為,脂肪酶活性與餌料無關[31,32]。在本研究中, 分別投喂活餌、飼料和轉食至35 dah的稀有逗鯽仔稚魚脂肪酶活性無顯著性差異, 結果與Nagase[31]和林浩然等[32]的研究一致。總體而言, 關于餌料與脂肪酶活性之間的關系有待更進一步研究。

很多學者認為, 胰蛋白酶活性與餌料中蛋白質含量有密切關系, 并進而影響仔稚魚的攝食和生長[9,31,33,34]。活餌中的某些微量活性物質可能是胰蛋白酶分泌的誘導因子, 可能會促進胰腺的分泌功能[35]。但也有研究證明, 活餌刺激對仔稚魚消化酶活性的影響幾乎可以忽略不計[36,37]。關于餌料與胰蛋白酶之間的關系學者們一直存在爭議。在本研究中, 經過轉食處理后稀有逗鯽仔稚魚胰蛋白酶活性顯著高于投喂活餌和單一投喂飼料。由于豐年蟲所含氨基酸存在不平衡的問題[14], 與飼料相比,氨基酸的總量較飼料低, 而魚蝦生長的限制性氨基酸[38]如甲硫氨酸, 在豐年蟲中的含量明顯低于人工飼料, 因此轉食則可以彌補這一缺陷并導致出現本實驗中所觀察到的胰蛋白酶活性在轉食組最高的現象。這提示單一投喂豐年蟲可能對于需要大量蛋白質的生長期有一定弊端, 但由于仔稚魚期的稀有逗鯽對蛋白質需求量不是很大, 因此單一投喂生物餌料或人工飼料并不影響其生長和發育, 均能滿足仔稚魚對蛋白質的需求。

結合存活率、生長和消化道發育總體分析, 活餌是仔稚魚期稀有逗鯽的最佳餌料。建議在標準化養殖時針對仔稚魚期的稀有逗鯽投喂活餌。但在稀有逗鯽幼魚及成魚期, 單一投喂活餌還能否滿足其對營養物質的需求, 是否會對生長和繁殖產生不利影響還未知, 有待更進一步研究。

圖版Ⅰ 稀有逗鯽仔稚魚消化系統組織學觀察PlateⅠ Histological observations of digestive system in juvenile G. rarus

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