兩種油脂水平下DHA添加對鯉生長及脂質代謝的影響

周繼術 曹艷姿 吉 紅 于海波

(西北農林科技大學動物科技學院水產科學系, 楊凌 712100)

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)主要來源于海水魚與藻類[1], 屬于n-3系列的高不飽和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acid, HUFA), 具有抗癌[2—4]、抗氧化[5—7]、防治心血管疾病[8]、提高免疫力[9,10]、調節脂代謝[11—13]等功能, 對大腦及神經系統發育[14,15]與視覺功能[16]密切相關。在水產動物上, DHA是海水魚尤其是海水仔稚魚正常生長發育的必需脂肪酸之一[17], 對黑鯛[18—20]、舌鰨仔魚[21]等海水魚脂質代謝也具有重要的調控作用, 而溫水性魚類如草魚、鯉等具有將18:3n-3合成為DHA的能力, 一般認為DHA并非溫水性魚類的必需脂肪酸, 然而DHA對魚類生長、脂代謝、細胞膜的流動性以及免疫功能顯示出重要的調控作用[22—27]。但是高濃度HUFA的添加會給機體帶來過高的過氧化壓力[28—30], 從而影響草魚組織脂質含量、抑制鯉及草魚脂質沉積[31—33], 還可能造成生長減緩、飼料轉化率降低等負面影響[34]。高濃度HUFA的添加對魚類造成的負面效應是否和飼料中其他脂肪酸或脂肪總量水平相關, 尚未見報道。

為了進一步了解不同油脂水平下DHA的添加對淡水魚類的營養生理作用, 本試驗以鯉(Cyprinus carpioL.)為對象, 在6%與12%兩個油脂水平下, 探討了3%添加水平下DHA對鯉生長、生物學性狀、體成份、血清理化性狀及組織結構的影響, 旨在為研究淡水魚類脂質營養及其代謝調控提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以酪蛋白、糊精、纖維素、大豆油以及復合魚用預混料等為飼料原料, 采用Lovell[35]試驗飼料配方配制鯉飼料。在6%與12%兩個油脂水平下, 以DHA制品(無錫訊達化學品廠, 江蘇, 無錫)分別替代3%的大豆油, 制成基礎組、基礎-DHA組、高脂組、高脂-DHA組4種等氮精制試驗飼料。將各原料均粉碎過60目篩, 將原料按比例混勻后壓制成直徑為2 mm長3 mm顆粒, 于冰箱冷藏保存備用。DHA制品的脂肪酸組成見表 1, 試驗飼料配方及營養成分見表 2。

1.2 試驗魚

試驗鯉購自陜西省周至縣某漁場。先挑選健康且個體相近的鯉馴養于容積為160 L的循環水養殖系統中, 經過7d馴養后, 選出體質健康的試驗魚360尾(14.81±0.13) g, 隨機分成4個組, 每組3個重復,每個重復30尾魚, 飼養于12個循環水養殖缸中。

1.3 飼養管理

將4組試驗飼料分別投喂4組試驗魚, 投飼率3.5%, 每天4次(8:30、11:30、14:30和17:30), 每次持續投喂時間為1h, 每次投食后清除殘餌和糞便。水源為經曝氣的自來水, 每天記錄水溫及試驗魚攝食等情況。試驗期間水溫(27±2)℃, 水流速度為20—30 L/h, DO＞6 mg/L, pH 7.5—8.0。飼養中期稱重一次以調整投飼量, 飼養試驗為74d。在飼養試驗結束后, 對所有試驗魚稱重并測量體長和取樣。

1.4 樣品采集及分析

在飼養結束后, 將試驗魚用濃度為100 mg/kg MS-222麻醉后, 隨機取9尾魚采血。將所有魚稱其體重并測量其體長, 再將魚進行解剖后, 分離其內臟、肝胰臟、脾臟、腸、腹腔脂肪、單側肌肉并稱重與量取魚腸長。將分離的肌肉與肝胰臟于-20℃保存備用。

鯉生長指標的測定試驗結束后, 稱取所有試驗魚體重, 其生長指標測定如下:

存活率(%)=末尾數/始尾數×100;

絕對生長率(g/d)=(末尾均重-始尾均重)/飼養時間(d);

紅琴平時很少叫風影的名字，開口閉口的總喚他和尚，林燕常常拿著風影敲過的木魚，坐在門檻上敲。他的眼神郁郁的，在懷想出家時的生活。風影又體味著塵世的樂趣，特別是在紅琴身上，他體驗著那種女人特有的味道，陽光的溫暖，雨絲的纏綿，蘭花的馨香。對于林燕，村子里的好事者有各種猜測，他們用各自的縝密的邏輯推理得出了一個又一個結論，有人說是紅琴落洞時山神在她身上播的種，也有人說是風影這個花和尚早就動了花心，和尚也是人，是男人都會想做那點事兒。嘴巴長在別人的臉上，人家要嚼舌頭風影有什么辦法。

相對生長率(%/d)=(末尾均重-始尾均重)/始尾均重×100;

飼料系數=飼料投喂量(g)/魚體增重量(g)。

鯉生物學性狀的測定分離魚體內臟, 稱取魚體空殼、肝胰臟、脾臟、腸、腹腔脂肪、單側肌肉等的重量并測量魚體腸長。鯉生物學性狀的測定指標如下:

肥滿度(g/cm3%)=魚體重(g)/體長(cm)3×100;

空殼比率(%)=空殼重(g)/體重(g)×100;

含肉率(%)=肌肉重(g)/體重(g)×100;

表 1 試驗油脂脂肪酸組成Tab. 1 Fatty acids composition of dietary oils (%)

表 2 半純化試驗飼料配方及營養成分組成Tab. 2 Ingredient and proximate composition of the semi-purified experimental diet

肝胰臟指數(%)=肝胰臟重(g)/體重(g)×100;

腹脂指數(%)=腹腔脂肪重(g)/體重(g)×100;

腸重比(%)=腸重(g)/體重(g)×100;

脾臟指數(%)=脾臟重(g)/體重(g)×100。

飼料與肌肉及肝胰臟常規成分的測定飼料、肝胰臟與肌肉常規成分的測定根據AOAC[37]法, 分別用索氏抽提法測定肌肉及肝胰臟的粗脂肪含量, 用半微量凱氏定氮法測定粗蛋白含量。

血清樣品制備和指標測定飼養試驗結束后每箱隨機取鯉9尾, 于其尾靜脈處采血, 3000 r/min離心10min, 制備血清。血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、總膽固醇(Chol)、甘油三脂(TG)、葡萄糖(GLU)等指標由生化試劑盒(中生北控生物科技有限公司, 北京, 中國)及全自動生化分析儀(島津ILAB600)條件下進行測定。

肝細胞及腹腔脂肪細胞觀察在飼養及饑餓試驗結束后, 每個處理隨機取3尾魚解剖, 分離腸道、肝胰臟、腹腔脂肪組織立即于波恩氏液中固定。24h后自來水洗滌, 不同濃度梯度的酒精脫水,二甲苯透明, 石蠟包埋, 連續切片, HE染色, 中性樹膠封片。光學顯微鏡下進行組織學觀察, 并利用顯微鏡的照相系統進行肝細胞直徑及腹腔脂肪細胞的長軸與短軸距離的測量。將脂肪細胞長軸與短軸距離相乘, 計算脂肪細胞的面積。

1.5 數據分析

所得數據采用平均數±標準差(Mean±SD)表示。用SPSS17.0軟件(Chicago, IL, USA)對試驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)以及Duncan’s多重比較檢驗組間差異,P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 DHA對鯉生長的影響

在6%油脂水平下, 基礎-DHA組末尾均重(43.7±0.8) g、絕對生長率(0.40±0.01) g/d與相對生長率(2.67±0.03)%/d均顯著低于基礎組(P＜0.05)。在12%油脂水平下, 高脂-DHA組絕對生長率(0.45±0.01) g/d顯著低于高脂組(0.49±0.01) g/d, (P＜0.05),而末尾均重與相對生長率在兩高脂組間均無顯著差異(P＞0.05)。基礎-DHA組的飼料系數顯著高于其他各組(P＜0.05), 而該飼料系數在其他三組間均無顯著差異。飼料的攝食量(3972—4212 g)與鯉的存活率(93%—99%)在各組間均無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 DHA對鯉生物學性狀的影響

由表 4可以看出: 基礎-DHA組魚體肥滿度最低且顯著低于高脂-DHA組(P＜0.05)。基礎-DHA組腹脂指數為(0.37±0.05)%, 顯著低于基礎組(0.52±0.04)%、高脂組(0.70±0.05)%及高脂-DHA組(0.67±0.06)%的腹脂指數(P＜0.05)。同時, 12%水平下的高脂組與高脂-DHA組的腹脂指數均高于6%水平下的基礎組與基礎-DHA組(P＜0.05)。空殼比率、含肉率、比腸長與脾臟指數等在各組間均無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 DHA對鯉體成分的影響

從表 5可以看出, 在12%脂肪水平下鯉肌肉與肝胰及粗脂肪含量均分別顯著高于6%脂肪水平組。在6%與12%脂肪水平下, DHA添加組的鯉肌肉粗脂肪含量[(1.82±0.07)%、(3.03±0.09)%]均分別顯著低于無DHA組[(2.58±0.07)%、(3.51±0.11)%;P＜0.05)]。鯉肌肉粗蛋白含量在各組間均無顯著差異(P＞0.05)。

表 3 DHA對鯉生長的影響Tab. 3 Effect of dietary DHA fortification on growth performance of common carp

表 4 DHA對鯉生物學性狀的影響Tab. 4 Effect of dietary DHA fortification on biological parameters (n=13)

表 5 DHA對鯉肌肉及肝胰臟粗脂肪與粗蛋白含量的影響Tab. 5 Effect of dietary DHA fortification on crude lipid and crude protein of muscle and hepstosomatese (n=3)

2.4 DHA對鯉血清生化組成的影響

從表 6可以看出, 高脂-DHA組谷丙轉氨酶為(126.9±31.2) U/L, 該值顯著高于其他各組(58.9—70.2 U/L,P＜0.05), 同時該組的總蛋白與球蛋白等均達到各組中的最高值, 分別為(33.98±1.02) g/L與(23.66±0.89) g/L。分別在6%與12%油脂水平下,DHA的添加均顯著升高了鯉血清膽固醇含量 (P＜0.05), 而DHA的添加有降低血清甘油三酯含量的趨勢。血清谷草轉氨酶、白蛋白、白球比與葡萄糖等指血清生化指標在各組間均無顯著差異(P＞0.05)。

2.5 DHA對鯉肝胰臟與腹脂組織的細胞大小的影響

從表 7可以看出, 6%脂肪水平下, 基礎-DHA組腹腔脂肪細胞面積為(67.5±7.0)×103μm2, 顯著低于基礎組; 當飼料脂肪水平上升至12%水平時, 兩組間魚體腹腔脂肪細胞面積無顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

3.1 DHA對鯉生長的影響

在黑鯛這樣海水魚的研究中發現, 飼料中添加1.5%DHA, 黑鯛生長及生物學指標均沒有顯著變化, 但飼料效率顯著增高[20]。DHA并非草魚、鯉等溫水性魚類的必需脂肪酸, 本研究結果顯示, 3%DHA制品的添加不但并未提高鯉的生長與飼料效率, 反而對其有明顯的抑制作用(表 3), 這與Du等[30]在草魚的研究中發現, 隨飼料中魚油添加量的增加, 草魚攝食率及表觀生長率下降相一致, 也與Takeuchi等[34]關于虹鱒飼料中添加過量n-3HUFA, 導致魚體生長下降、飼料轉化效率降低的研究結果相一致,也與鯉、草魚[31—33]的研究結果相一致。

DHA的高不飽和性使其易受氧或其他自由基的攻擊, 從而產生有害的過氧化產物, 這些過氧化產物的產生會損傷體抗氧化能力[25,37—39]。然而, 也有研究發現, DHA能夠增強機體抗氧化酶活性以及促進自由基的清除[6,8,40—42]。因此, DHA對機體抗氧化能力的影響尚不明確。本研究結果顯示, 3%DHA制品的添加不但未能提高鯉的生長與飼料效率, 反而對其有明顯的抑制作用(表 3), 雖然本次試驗沒能檢測谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物岐化酶等抗氧化指標, 然而結合本次試驗結果, 筆者推測,DHA添加組的鯉較差的生長效果可能與DHA的添加與食入有關; 易于氧化的DHA在沒有額外的抗氧化物質, 如維生素E的供給, 會給鯉機體帶來過高的過氧化壓力, 從而帶給鯉較高的氧化應激, 進而影響鯉的生長, 降低鯉的飼料轉化效率, 而這一結果在鯉的以往研究[34]及哺乳動物[43]中均有類似發現。

3.2 DHA對鯉脂質代謝的影響

在本試驗的研究結果中發現, DHA的添加, 魚體肥滿度、腹脂指數、腹腔脂肪細胞面積與肌肉粗脂肪含量均低于同一脂肪水平下的無DHA的添加組(表 4—7)。本研究與Om等[18,19]的研究結果:飼料中DHA降低了黑鯛腹腔脂肪細胞脂質蓄積和細胞直徑大小相一致。

表 6 DHA對鯉血清生理生化指標的影響Tab. 6 Effect of dietary DHA fortification on serum biochemical index (n=3)

表 7 DHA對鯉肝胰臟與腹脂組織的細胞大小的影響Tab. 7 Effect of dietary DHA fortification on cell area of hetopancreas and adipose tissues (n=3)

DHA等多不飽和脂肪酸(PUFA)是動物生命活動的重要能量來源, 也是細胞膜的重要組成成分,在細胞表面信號傳導以及細胞生化代謝過程中起著重要作用[44]。對嚙齒動物的研究表明, n-3PUFA能降低肥胖[45]。進一步的研究發現, PUFA能與鼠等哺乳動物中的肝臟過氧化物酶增殖物激活受體(PPARs)、固醇調節元件結合蛋白(SREBP)、X受體 (LXRs)等核受體特異性地結合, 使PUFA調節相關酶的轉錄基因, 從而減少脂肪合成和體脂沉積,促進了脂肪降解[44,46,47]。研究表明, 與陸生動物一樣, PUFA能從分子水平上激活大西洋鮭PPAR受體, 調節相關酶的轉錄基因, 抑制脂合成酶的活性,促進脂肪降解, 最終減少體脂沉積[48—50]。因此, PUFA等長鏈脂肪酸是一種調控能量代謝的物質[51], 它通過作用于PPARs、SREBP等核受體實現對細胞脂質代謝的調控[52]。本研究室對水產動物尤其是對草魚的長期研究也發現, DHA等PUFA對草魚脂肪細胞發育及某些脂質氧化代謝基因, 如三酰甘油酯酶(ATGL)、過氧化物酶體增殖受體α激活因子1(PGC-1α)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)等有顯著影響[33,53—55], 從而促進了脂質的氧化。雖然本次試驗并未檢測以上脂質代謝基因, 但本研究結果顯示, DHA的添加降低了魚體肥滿度、腹脂指數、腹腔脂肪細胞面積與肌肉粗脂肪含量, 為此,筆者推測, 這一結果可能與DHA促進了鯉脂質及脂肪酸的氧化代謝有關, 同時, 本試驗結果與DHA的添加影響草魚組織脂質含量、抑制鯉及草魚脂質沉積的研究結果[31—33]相一致。

在塞內加爾舌鰨(Solea senegalensis)的研究發現, 提高DHA及飼料油脂水平, 將提高其生長率, 反之則降低其生長率[56]。本研究發現, 隨飼料脂肪水平的提高, DHA的添加對鯉生長、肥滿度、腹脂指數、腹腔脂肪細胞面積、肌肉粗脂肪含量與血清膽固醇含量等的抑制作用均有減輕的趨勢(表3—7), 顯示出脂肪水平對DHA添加所造成的損傷的補償作用。

在本實驗中添加DHA使鯉血清膽固醇含量并未顯著降低(表 6), 這與飼料PUFA有降低哺乳動物血漿膽固醇含量的研究結果作用[57,58]不一致。HUFA對魚類膽固醇代謝的影響與哺乳動物不同的原因還有待進一步研究。鯉血清甘油三酯含量隨DHA添加有降低趨勢(表 6), 這在鼠[59]上也有類似的研究結果。研究表明, DHA對鯉脂質代謝具有調控作用, DHA作為鯉的非必需脂肪酸, 其利用能力及其作用機制可能與哺乳動物不同, 其相關機制還需進一步研究。

4 總結

3%DHA制品的添加不但并未提高鯉的生長與飼料效率, 反而對其有明顯的抑制作用。與此同時,DHA的添加對魚體肥滿度、腹脂指數、腹腔脂肪細胞面積與肌肉粗脂肪含量均有抑制作用, 這可能與DHA的添加量可能超過了鯉的營養需求量, 從而對魚體形成了的過氧化壓力, 進而影響了魚機的生長與健康有關。隨飼料脂肪水平的提高, DHA的添加對鯉生長、肥滿度、腹脂指數、腹腔脂肪細胞面積、肌肉粗脂肪含量等所形成的抑制作用均有減輕趨勢, 顯示出提高飼料脂肪水平可在一定程度下補償DHA添加所造成的機體損傷。

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