基于MATLAB軌跡跟蹤研究重金屬銅對鰱幼魚自發游泳行為的影響

靖錦杰 黃應平, 袁 喜 雷幫軍 蔣 清 涂志英,

(1. 三峽大學水利與環境學院, 宜昌 443002; 2. 三峽大學三峽地區地質災害與生態環境湖北省協同創新中心, 宜昌 443002;3. 三峽大學計算機與信息學院, 宜昌 443002; 4. 三峽庫區生態環境教育部工程研究中心, 宜昌 443002)

銅是水體常見的重金屬污染物, 對水生無脊椎動物、兩棲動物和魚類等水生生物均具有較強的毒性, 能通過生物富集和生物放大效應對水生生態系統產生重要影響[1—3], 日益引起人們對其的普遍關注[4]。

鰱(Hypophthalmichthys molitrix) 屬鯉形目鯉科, 是我國四大家魚之一, 也是長江重要的經濟魚類且廣泛分布在全國各大水系[5]。已有研究表明重金屬對鰱幼魚和魚胚胎均具有明顯的毒性[6], 且對鰱肝組織SOD和CAT活性影響顯著[7]。此外, 長江沉積物中銅的富集系數較高, 對中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)的游泳能力[8]和草魚(Ctenopharyngodon idellus)幼魚的臨界游速和耗氧率均有顯著抑制作用[9]。

視頻是記錄魚類行為的一般形式。魚類行為研究的主要問題就是怎樣從拍攝的視頻中高效準確的提取魚類行為數據。用傳統方法獲取諸如魚的位置、方向、擺幅、頻率等數據一般是通過手動測算實現的。手動測算具有勞動密集、主觀依賴性強等缺點, 從而導致監測效率低、行為精準度受限[10]。 近幾年來, 計算機視覺技術也應用到魚類的行為學研究之中, Rillahan等[11]采用多臺攝影機記錄實驗魚的三維坐標信息, 通過HTI模型291超聲波遙測系統精確描繪其運動軌跡, 定量研究運動行為, 石小濤等[12]利用Swis Track軟件分析鰱幼魚游泳行為, Huang等[13]利用一套實時監測系統分析了斑馬魚(Barchydanio rerio var)對不同濃度的溴氰菊酯行為響應關系。本研究利用MATLAB軟件, 研究重金屬銅離子濃度對鰱幼魚自發游泳行為的影響,采用原子吸收分光光度法檢測魚體內各部位重金屬含量的變化, 從生理上分析運動行為變化的原因,探索環境因子對魚類的影響, 為生物預警和水質監測等方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的鰱幼魚由宜都水產市場提供, 魚體長為(10.4±0.5) cm, 體質量為(13.7±1.3) g。實驗魚在180 cm×40 cm×60 cm的魚缸中馴化2周。按照魚體重的5%, 每天08:00投喂漁用配合飼料(粗蛋白質≥45%, 脂肪≥10%, 粗纖維≤3%, 粗灰分≤17%)。用空氣泵向魚缸內充氧, 光照為自然光照,水溫用一套循環冷水儀控制, 保證實驗裝置中水溫為(20±1)℃。實驗前禁食48h, 避免消化活動對實驗產生影響[14]。

1.2 實驗裝置

本文所有的視頻數據采集通過簡易計算機視覺系統(圖1), 該系統包括1個白色LED燈組成的光源、一臺攝像機和一臺含圖像采集卡電腦。LED光源安裝在水槽的正下方用來增加亮度和減少陰影, 并確保實驗魚處于均勻光照背景下進行拍攝。攝像機安裝在實驗水槽的正上方, 鏡頭正對下方水面, 將攝像頭調到能正常覆蓋全部水槽即可[15]。試驗拍攝得到的視頻圖像分辨率為720×480像素, 幀率為15幀/s。實驗使用玻璃水槽的長×寬×高為50 cm×40 cm×25 cm, 實驗時水位為10 cm。

圖1 魚類行為視頻監控裝置Fig. 1 The video monitoring device for fish behavior

1.3 實驗步驟

正式實驗前, 根據水質對淡水魚急性毒性測定方法(GB 12997-91)完成預實驗, 設置5個不同水體銅濃度曝露96h, 選50尾魚測定96h-LC50的值為4.05 mg/L; 根據預實驗結果, 設置5個不同濃度組(0、1、2、3、4 mg/L), 將健康的30尾魚隨機放入5個梯度水槽中暴露96h, 暴露期間不喂食, 每日定時換水(日換水量為水體的50%)并補充相應濃度的CuSO4溶液以保持水體銅濃度基本恒定, 其他實驗條件不變。之后逐一將實驗魚轉移到視頻監控裝置中(濃度和之前暴露水槽一致), 監控記錄魚60min的行為變化, 取最后5min的運動視頻[10], 觀察魚的呼吸頻率, 再用MATLAB軟件將圖像分割, 用光流法分析出魚體中心點的位子, 最后利用坐標得到速度、加速度、運動路程等關系圖; 實驗結束后, 立即將魚麻醉, 解剖, 取其肝臟、鰓、肌肉組織,利用原子吸收儀得到不同部位的重金屬銅含量。

1.4 測試方法及主要參數

呼吸頻率的測定實驗全程由高清攝像頭記錄, 現場視頻觀測得到魚5min呼吸頻率Vf, 呼吸頻率計算公式如下:

式中,N表示記錄時間段魚呼吸的總次數,T表示記錄時長。

游泳速度、加速度及總路程的測定將實驗錄好的視頻, 導入到由MATLAB編程得到的CT函數中, 處理成圖片格式后進行標記, 運行MATLAB軟件, 即可自動輸出實驗魚的位置坐標,利用兩點之間距離公式和速度加速度運動學基本公式, 可得到運動路程, 速度, 加速度等主要實驗參數, 計算公式如下:

式中, ΔS表示連續兩幀時間內實驗魚的運動距離;Xn,Yn表示前一幀實驗魚的位置坐標;Xn+1,Yn+1表示連續的后一幀的位置坐標;Sn表示前n幀的運動總距離;V表示實驗魚的運動速度;a表示實驗魚的運動加速度;Vn,Vn+1表示連續兩幀的速度; Δt表示每幀所用的時間(幀率為15幀/s)。

各組織中重金屬含量的測定在視頻錄制完畢后, 將實驗魚用丁香酚溶液(丁香酚溶液/乙醇=1/9, 5 mL混合液溶入10 L水中)麻醉(5min), 取其肝臟、鰓、肌肉組織并于-40℃低溫保存。將各組織樣本(以相同處理方法的6尾魚組織為1個樣本)稱量, 取濕重, 放置于消解罐(50 mL)中消解, 采用原子吸收分光光度計測定組織Cu2+含量。

1.5 數據處理

實驗數據以Excel 2003 進行常規計算, 實驗數據在SPSS20.0中進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差數法(LSD)檢驗差異顯著性。統計數據表示為平均值±標準誤(mean±SE), 顯著性水平為P=0.05。

2 結果

2.1 水體銅離子對鰱幼魚運動時長和呼吸頻率的影響

急性水體銅暴露對鰱幼魚的運動時長影響顯著(F5,29= 74.39,P≈0.000＜0.001)。隨著水體銅離子濃度增加, 運動時長逐漸減小, 與對照組相比, 在2.00和4.00 mg/L時影響顯著(圖2)。分別比對照組減少了37.90%和72.41%; 由圖3可知, 呼吸頻率在1.00 mg/L時略有升高但不顯著, 當濃度升至2.00和3.00 mg/L, 呼吸頻率顯著下降(P＜0.05), 在4.00 mg/L時銅離子的影響極其顯著(P＜0.001), 此時鰱呼吸壓迫明顯。

圖2 急性銅暴露對鰱幼魚運動時間比的影響Fig. 2 The effect of acute copper exposure on the moving of juvenile silver carp

圖3 急性銅暴露對鰱幼魚呼吸頻率的影響Fig. 3 The effect of acute copper exposure on respiratory rate of juvenile silver carp

2.2 水體銅離子對鰱幼魚5min的運動速度及加速度和總路程的影響

圖4 是在每個濃度下隨機選取一條魚分析其運動坐標而生成的[10]。結果表明隨著濃度的增大, 鰱幼魚的平均速度逐漸減小, 在正常情況下平均速度為44.86 mm/s, 而在最大濃度4 mg/L時, 其平均速度為29.50 mm/s, 利用最小顯著差數法(LSD)檢驗可知兩者差異顯著(組距15.36＞LSD0.01=4.146)。

加速度可以看作魚突遇危險快速逃避的能力,由圖4可知隨著濃度增加, 加速度逐漸減小, 0時的正加速度為66.98 mm/s2, 2 mg/L時為68.13 mm/s2, 但兩者差異性不明顯, 而與4 mg/L時加速度為45.18 mm/s2存在顯著差異(P＜0.05), 且所有組的實驗魚在加速運動過程中的數值要大于減速運動的值。

由速度圖形中提取的實驗魚運動5min總距離可以被看作一個描述實驗魚運動行為的單一行為參數[10]。這個總距離可以通過公式(2)得到相鄰兩點的距離再將所有小段求和得到的, 通過統計學分析得到5min內運動距離的均值和標準誤。在0和1 mg/L時并無顯著差異, 0與2和3 mg/L相比差異性明顯(P＜0.05)而在4 mg/L時差異性更加顯著(P＜0.001), 隨濃度增大, 實驗魚的總運動距離下降(圖5)。

2.3 鰱幼魚鰓、肝臟和肌肉組織銅含量特征

采用靜水急性毒性試驗法測定銅對鰱的毒性,統計銅污染暴露24h、48h、96h后鰱幼魚的死亡率,由直線內插法計算[9]獲得LC50分別為8.03、6.54和4.05 mg/L, 根據96 hLC50×0.1計算安全濃度為0.4 mg/L, 急性銅離子暴露對鰱幼魚鰓(F=1.69;P=0.498)、肝臟(F=2.37;P=0.095)和肌肉(F=1.73;P=0.298)組織干重的銅含量均無顯著影響。重金屬含量大小順序為肝臟＞鰓＞肌肉(圖6)。

3 討論

3.1 水體銅離子對鰱幼魚運動時長和呼吸頻率的影響

運動時長和呼吸頻率可作為直觀判斷鰱幼魚運動能力強弱的參數指標, 本研究發現, 隨著銅離子濃度升高, 鰱幼魚對應的運動時長和呼吸頻率均減小。相關研究表明低溫脅迫對南方鲇(Silurus meridionalis)和瓦氏黃顙魚(Pelteobaggrus vachelli)呼吸頻率影響明顯[16], 姜禮潘等[6]也發現熱污染對魚類呼吸頻率影響顯著, 隨著溫度的升高而逐漸變大。水體銅離子對雜交鱘白細胞、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的影響表現出一定劑量效應關系: 同一濃度時, 隨著暴露于銅離子的時間延長, 各指標逐漸降低且白細胞和抗氧化酶活性明顯降低, 說明高濃度水體銅抑制其免疫和抗氧化功能, 隨著濃度的增大, 雜交鱘的呼吸頻率和擺尾頻率逐漸減小[17];黃溢明等[18]在研究重水體銅離子對鯽(Carassius auratus)和鯉(Cyprinus carpio)呼吸機能影響時發現, 鯉科魚對重金屬離子較為敏感, 銅離子易與鰓上皮分泌的黏液結合成一種不溶解性的金屬蛋白質化合物, 影響呼吸作用, 濃度越大, 影響越嚴重,結果與本研究相似。

圖4 急性銅暴露對鰱幼魚5min內速度和加速度的影響Fig. 4 The effect of acute copper exposure on the velocity and acceleration of juvenile silver carp in 5min period

圖5 急性銅暴露對鰱幼魚5min運動總距離的影響Fig. 5 The effect of acute copper exposure on total distance of juvenile silver carp in a 5-min period

圖6 急性銅暴露后銅離子在鰱幼魚鰓, 內臟及肌肉中的含量Fig. 6 Copper contents of gill, liver and muscle of juvenile silver carp after acute exposure

3.2 水體銅離子暴露對鰱幼魚游泳行為的影響

游泳速度是魚類游泳能力最為直接的評價指標, 主要包括巡航(續航)游泳速度、沖刺游泳速度、臨界游泳速度等。目前, 越來越多的學者傾向于使用臨界游泳速度評價魚類的游泳能力, 但在整個魚類生活史來看, 魚類的巡航速度是最常用的1個指標, 并且魚類對環境變化反應敏銳, 因此研究魚類自發游泳速度的變化可以作為檢測水體污染嚴重程度的一個重要指標。Huang等[13]利用視頻技術研究斑馬魚對不同溴氰菊酯濃度短暫暴露后行為響應關系時發現, 在實驗開始階段, 游泳速度先增加后降低; Zhu等[12]在利用立體視覺系統實時監測水生生物的3D行為時發現, 隨著酒精濃度的增加, 金魚(Carassius auratus)的速度, 5min運動的總路程呈增加趨勢, 這些游泳速度, 總路程, 總轉角等可以很好的描述魚類的自發運動, 這種詳細、連續振蕩型動物運動信息更有說服力, 更利于系統分類和精確區分復雜的動物表型。中華倒刺鲃幼魚在急性銅暴露96h后, 其相對臨界游泳速度、相對爆發游泳速度、最大代謝率受銅暴露影響顯著, 銅暴露導致以上各參數值下降[8]; 草魚幼魚的相對臨界游泳速度以及耗氧率均暴露96h后呈下降趨勢[9], 本研究發現隨著銅離子濃度增大, 運動平均速度, 加速度和運動總路程均被抑制, 結果與上述研究相似[19—21]。據文獻[22]報道, 水體中的銅會影響魚體內琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性, 從而影響體內有氧代謝, 使魚類游泳速度, 運動路程降低, 這也可能是本研究中的鰱在銅溶液中暴露后游泳能力下降的原因。標記與監測技術直接決定了行為學研究的尺度和精度, 近年來, 水生動物行為學的研究開始采用基于計算機視覺系統的圖像處理技術, 潘洋等[23]通過視頻檢測方法, 建立了刺參運動行為評價體系,以運動路程、累積運動時間、平均運動速度和最大運動速度為實驗指標, 綜合評價刺參的運動行為生態特征, 為刺參的野外檢測和水產養殖提供了精確的數據支持。通過魚的游泳速度、加速度、運動總路程等行為特征來反應水體的污染程度, 比使用致死率更迅速、準確, 且更適合用于野外在線監測。

3.3 鰱幼魚鰓、肝臟和肌肉組織銅含量特征

高濃度的Cu對于魚類的行為反應、生理指標和組織結構等產生較大影響, 可表現出較強的毒性,引起魚類中毒甚至死亡[24], 但是由于不同區系生物受生活環境等因素的影響, 對銅的耐受性和敏感度存在很大的差異[25], Gioda等[1]對脂鯉(Leporinus obtusidens)進行了長期銅暴露研究發現銅暴露處理后脂鯉肝和肌肉中的銅含量與對照組無顯著差異;而張怡等[8]對中華倒刺鲃用急性銅暴露96h后發現,魚體肝臟、鰓和肌肉組織銅含量無顯著變化的情況, 袁喜等[9]在研究急性銅對草魚的影響時也發現類似規律。在本研究中, 水體銅暴露對鰱幼魚肝臟、鰓和肌肉組織銅含量影響均不顯著, 和上述結果相近, 鰓直接暴露在重金屬環境中, 因而測得積累較大; 肝臟是金屬硫蛋白(Cu-MT)合成的主要場所, 含量增加明顯; 而肌肉代謝較慢, 而且沒有直接暴露于重金屬[26,27]。因此, 魚類對重金屬的累積量為肝臟＞鰓＞肌肉。Cu-MT含量增加, 加速了Cu2+在魚體內的代謝進程, 多余的Cu2+結合蛋白進入血液循環, 并排泄到體外[28]。因此急性銅暴露后, 各組織重金屬累積量均無顯著差異。重金屬產生的環境脅迫產生的應激行為反應機理十分復雜, 有待進一步的研究。

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