膝骨關節炎軟骨損傷及組織工程學修復

曹 曦 馮 洋 路 通 崔 偉

(廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530001)

膝關節軟骨作為脛骨與股骨連結組成部分能減輕關節摩擦和提供緩沖以保證肢體正常活動和穩定負重。膝骨性關節炎中關節軟骨退變、軟骨下骨贅增生及滑膜炎癥等會破壞軟骨組織〔1〕，導致關節疼痛、關節交鎖征、關節畸形等異常表現，膝關節軟骨長期不可逆損傷會使患者喪失關節功能，嚴重影響患者生活質量。目前針對膝關節軟骨早期損害的手術治療方法包括軟骨膜移植及自體骨軟骨鑲嵌移植成形術等，終期治療手術為關節置換術〔2〕。但是這些方法存在關節內粘連、感染、移手術失敗等缺陷〔3〕。使用軟骨組織工程支架、種子細胞和生長因子能夠對原生軟骨屬性進行仿生，提高軟骨修復效果。本文對膝骨關節炎軟骨損傷及組織工程學修復的研究現狀進行綜述。

1 膝骨關節炎與軟骨損傷

膝關節炎關節軟骨損傷的具體機制仍未明確。關節軟骨由其唯一的固有細胞軟骨細胞和軟骨細胞外基質(ECM)共同構成〔4〕。軟骨細胞在膝關節骨性關節炎進程中對損傷做出反應，維持組織內穩態，并執行軟骨重建。膝骨關節炎條件下的軟骨細胞活動信號會發生改變，退變的軟骨細胞容易被誘導增殖分化為肥大軟骨細胞，由軟骨細胞分化而成的肥大軟骨細胞會使軟骨的生物特性發生變化，軟骨應力和維持自身完整性的能力下降會導致軟骨在應力條件下遭到侵襲和破壞〔5〕。正常的軟骨細胞能夠對Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖和透明質酸的生成和代謝進行調節以維持軟骨ECM的基礎結構及軟骨的生物力學性能。在骨關節炎進程中，軟骨細胞會影響軟骨ECM大分子物質的代謝和合成〔6〕。軟骨ECM合成分解代謝異常會激動關節內環境中的巨噬細胞及其他免疫細胞釋放包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-22等在內的促炎細胞因子，這些促炎細胞因子會通過改變軟骨細胞功能加速軟骨損傷進程〔7〕。軟骨細胞在對IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子進行應答時還會釋放出如人基質金屬蛋白酶(MMP)-13和血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS)-5等大量蛋白酶，而這些蛋白酶會破壞膠原、軟骨低聚基質蛋白(COMP)和黏多糖等從而損害軟骨正常功能〔8〕。此外，膝關節炎患者軟骨下骨成骨細胞(SBOs)也會使軟骨細胞表型和功能發生變化，表型改變后的軟骨細胞合成可聚蛋白多糖能力下降而軟骨ECM特異性酶生產能力會上升，上升的特異性酶與關節炎癥及軟骨破壞進程密切相關〔9〕。軟骨破壞和關節炎發病機制中成纖維樣滑膜細胞(FLSs)也發揮著關鍵作用，受損軟骨細胞會通過釋放膠原蛋白刺激FLSs分泌MMPs，加劇軟骨降解。

總之，膝骨關節炎軟骨損傷和軟骨細胞及ECM功能障礙密切相關，膝骨關節炎會導致ECM和軟骨細胞異常。軟骨細胞和ECM異常，各種因素相互作用使軟骨更易被磨損，而磨損的軟骨也會促使機體釋放各種物質加重膝骨關節炎，因此對于對膝關節炎的受損軟骨進行修復顯得十分重要。

2 軟骨組織工程學

模擬原生軟骨的結構、成分及信號環境促進軟骨再生是軟骨組織工程領域的研究重點。軟骨損傷修復的組織工程學方法需要通過細胞及生物支架完成，種子細胞通常會被轉移至具有軟骨ECM特性的生物支架上，生物支架能夠模擬ECM微環境為種子細胞存活、增殖及分泌活動提供支持。用于搭載種子細胞的生物支架具有可降解性，生物支架降解后，種子細胞能夠進行分化并以吸附方式對軟骨的受損部位進行修復，種子細胞的分化需要生長因子誘導和機械刺激完成。此外受損部位也會通過高自導信號釋放趨化因子和細胞激素促進修復〔10〕。

2.1種子細胞 雖然目前研究人員對軟骨細胞、成纖維細胞、干細胞和轉基因細胞等都進行了研究，但是目前軟骨修復研究最多還是自體軟骨細胞和間充質干細胞(MSCs)。

2.1.1自體軟骨細胞 成人的自體軟骨細胞的優點為能夠合成并分泌ECM、獲取方便、免疫排斥風險低等。自體軟骨細胞可以從關節軟骨、鼻中隔、肋軟骨或耳廓軟骨中分離獲得。研究發現〔11〕，利用如鼻中隔或耳軟骨細胞等非關節軟骨類軟骨細胞作為細胞來源增殖率更高，供區并發癥發病率也更低。研究表明〔12〕，骨關節炎衍生的自體軟骨細胞也能作為種子細胞用于軟骨組織工程。通過自體軟骨細胞移植能夠改善早期膝骨關節炎患者生活質量和減輕患者的疼痛癥狀。

2.1.2MSCs MSCs具有增殖潛能良好、組織來源豐富和分化誘導方式多樣等優點。MSCs能夠通過調節免疫、血管生成、抗凋亡、抗纖維化和抗炎分泌物來發揮其再生作用〔13〕。關節注射MSCs也已被證明對膝骨關節炎損傷軟骨具有改善作用，但是MSCs關節注射具有包括細胞成活率有限等局限性〔14〕。MSCs可通過特定因素誘導或刺激分化為成軟骨細胞。目前誘導MSCs分化可以通過三維細胞培養、低氧張力和機械刺激等方法完成。三維細胞培養能夠使MSCs保持或恢復與軟骨細胞相類似的表型〔15〕，三維細胞培養還能夠有力地促進MSCs分化。低氧條件下處理MSCs可以促進誘導MSCs生成軟骨，還可以防止MSCs肥大化〔16〕，同時缺氧誘導因子(HIFs)能夠促進軟骨ECM基因的表達〔17〕。

2.2生物支架 通常用于制作軟骨組織工程生物支架的材料應具有理化可調性。用于制作支架的生物材料分為天然與人工聚合物兩種，其中天然聚合物又可以分為蛋白質或碳水化合物型〔18〕。從生物學角度來說，制作支架的理想生物材料必須具有生物相容性且無毒性，以防止其引發宿主炎性及免疫反應；從結構角度來說，制作生物支架的材料還必須能夠為軟骨細胞表型的三維培養及保證細胞能夠牢固黏附和填充于受損位置提供支持；從組成成分角度來說，生物材料還必須具有通透性，能夠允許分子、無機物及生長因子進行擴散，用于制作支架的生物材料通常還應該具備生物可降解性、可注射或剛性結構及可以通過微創方式整合重塑關節軟骨〔19〕。

可用于制作生物支架的天然聚合物包括纖維蛋白膠、膠原、蠶絲蛋白、藻酸鹽、殼聚糖、透明質酸等，這些天然聚合物制作的生物支架具有良好的降解性、親水性和細胞黏附性，但機械性能欠佳。制作支架常用的人工聚合物包括聚乳酸(PLA)、PLA-羥基乙酸共聚物(PLGA)和聚己內酯(PCL)等，這些聚合物都具有良好機械性能和可調性，但是可降解性能和生物活性欠佳。天然生物聚合物通常被廣泛用于制造水凝膠支架，而高分子聚合物支架通常以人工聚合物為材料〔20〕。但是目前研究人員正致力于將天然聚合物和人工合成物相結合以制作出生物相容性更高、性能更優的生物支架用于軟骨修復〔21〕。

2.2.1水凝膠 水凝膠生物支架一直是生物支架制作領域的研究熱點。以水凝膠為生物材料制作的組織工程支架具有以下多項優點：具有與軟組織相似的特性和性質，能夠為封裝細胞提供了結構支持；具有良好的溶脹性和潤滑性；能夠對機械應力進行傳導；能夠允許其所搭載的細胞保持球形形態，而軟骨細胞的表型特征即為球形形態〔22，23〕。水凝膠的這些特性可以維持軟骨細胞表型和細胞生長提供穩定的環境。目前還有研究人員將水凝膠和生物打印技術相結合對水凝膠生物特性進行調控，用于軟骨結構功能修復研究〔24，25〕。但是水凝膠生物支架還存在如機械強度不理想等一些缺點。因此今后的研究需要材料學家與組織工程及其他相關學科研究人員交叉合作，共同開發力學性能更高、降解速率更好、生物相容性更高的水凝膠支架用于修復軟骨損傷。

2.2.2纖維蛋白膠 天然聚合物纖維蛋白膠作為良好黏合劑和止血劑被廣泛運用于臨床。纖維蛋白膠具有良好的生物相容性且能夠促進細胞和ECM相互作用〔26〕。纖維蛋白膠還能夠承受較大負荷，能夠有效維持其原有形態及大小。纖維蛋白膠還能夠促進軟骨細胞的增殖和軟骨組織ECM生成。在兔子實驗生上已表明，使用纖維蛋白膠作為生物支架材料，可以通過控制纖維蛋白原的濃度從而對纖維蛋白膠的降解速率和聚合時間進行調節。纖維蛋白膠也能夠通過結合其他聚合物(如聚氨酯等)來調節種子細胞的生物活性和分布狀況。

2.2.3殼聚糖 殼聚糖為半晶體聚合物，其結晶程度與脫乙酰程度有關，在體內可通過溶菌酶降解為寡糖。殼聚糖表面具有親水性，能夠促進細胞的增殖、增殖和分化。通過控制冷凍溫度和脫乙酰度，殼聚糖能夠被制作成孔隙分布良好的生物支架用于軟骨骨組織修復〔27〕，這也是殼聚糖最有研究價值的特有表現之一。研究發現〔28〕，使用特殊處理后制作的殼聚糖水凝膠支架，在修復軟骨組織時能夠使局部形成更多黏多糖和Ⅱ型膠原。

2.2.4蠶絲蛋白 蠶絲蛋白作為天然蛋白聚合物具有以下特征：機械性能可塑性、生物相容性、低免疫原性、限制細菌黏附、生物降解可調性等等。蠶絲蛋白生物支架具有理想的生物活性，能夠進細胞黏附和生長。但是天然蠶絲蛋白支架有可能會引起機體免疫反應。有研究人員制作了一種低免疫原性的軟骨素蠶絲蛋白支架用于軟骨修復，這種支架的在體和體外研究結果都顯示這種低免疫原性支架能夠用于軟骨修復〔29〕。

2.2.5纖維支架和多孔海綿 纖維支架具有機械性能優異、結構可調性高、可降解、無毒、制造簡便等優點。纖維支架也會通過其孔隙分布、纖維方向及纖維直徑等性質對其所搭載細胞的排列、分布和遷移產生一定影響。纖維支架的機械力學性質和小牛軟骨相類似。纖維支架的缺點為脆性差、無誘導作用和可降解性能不佳等。PLA是在所有材料中親水性最好，PLA的代謝產物能被完全吸收。PLA和PLGA的降解性能和機械性能更佳且無毒性，同時PLGA的降解性能和機械性能還能夠通過調控二者比例進行調整。因此PLGA在軟骨組織工程學中的一種前瞻性材料。PLGA的缺點為親水性較差，吸收不佳。研究人員通過使用靜電紡織對PLGA支架進行改良發現，改良后的PLGA支架可以成功用于軟骨組織工程修復〔30〕。

多孔海綿支架的性質與纖維支架相類似。多孔海綿的孔隙大小和孔隙分布等會影響細胞黏附、相互作用及細胞形態學和結構力學性能。高孔隙度使多孔海綿能夠為軟骨細胞表型提供更好的三維結構支持。研究人員發現，軟骨細胞在一種Ⅰ型膠原蛋白/多孔海綿支架中能夠最好地維持球狀表型〔31〕。但是多孔海綿的多空隙也導致了其機械性能不佳，如何研發出性能更佳的多孔海綿支架是今后研究的重要方向。

2.3生物學要素 種子細胞誘導分化為軟骨細胞需要多種生長因子和形態發生決定子參與完成。這些因子主要包括轉化生長因子(TGF)-β、成纖維細胞生長因子(FGFs)、表皮生長因子(EGF) 、胰島素樣生長因子(IGF)和骨形態發生蛋白(BMP)、結締組織生長因子(CTGF)等。研究人員發現，自體軟骨細胞功能障礙時表型會發生改變易分化為成纖維細胞，但是通過使用三維細胞培養和對FGF-2、EGF、 TGF-β及血小板衍生因子(PDGF)-BB等進行調控可以使障礙的軟骨細胞進行反分化。

TGF-β家族成員TGF-β1和β3生長因子對MSCs分化起到重要作用。因此使用TGF-β1和TGF-β3是誘導MSCs分化最常用的方法〔32〕，其中TGF-β3的誘導能力更是居于TGF-β家族前列。BMP能夠調控軟骨形成同時還會影響成骨，其中BMP-2能夠促進Ⅰ型膠原蛋白基因表達，Ⅱ型膠原和糖胺聚糖的沉積。CTGF在刺激MSCs向軟骨細胞分化過程中能夠對軟骨細胞的增殖和分化促進起促進作用，從而增加軟骨細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達。缺乏CTGF會使MSCs在分化過程中增加腱調蛋白(TNMD)表達使軟骨細胞韌帶化〔33〕。

綜上，膝骨關節炎軟骨損傷一直是臨床診治的難點。軟骨組織工程在過去的幾年里有了很大的發展，軟骨修復的方法越來越多，成功率也越來越高。然而，膝骨關節炎是一種多因素作用導致的軟骨內環境穩態和關節炎癥交錯作用的復雜疾病。因此，治療膝骨關節炎軟骨損傷需要從多種角度選擇不同的組織工程策略進行治療。

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