加米霉素注射液在靶動(dòng)物豬的安全性試驗(yàn)

肖天石，丁久恒，于泓瀟，楊 芳，秦 鵬，劉 波，張秀英

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.牡丹江市畜牧獸醫(yī)局，黑龍江 牡丹江 157009；3.冀中生物科技有限公司，河北 保定 071100)

加米霉素為第二代大環(huán)內(nèi)脂類半合成獸用抗生素，屬于氮雜內(nèi)酯類，其中7α-內(nèi)酯環(huán)中的定位烷基化氮能夠使加米霉素被靶器官肺快速吸收[1-3]。與其他大環(huán)內(nèi)脂類抗生素作用機(jī)制相同，加米霉素通過與原核生物的核糖體50S亞基結(jié)合抑制mRNA位移，從而影響蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而起到抑菌和殺菌的作用[4-7]。法國(guó)梅里亞公司研發(fā)的以加米霉素為主要成分的注射劑ZACTRAN分別于2008年7月和2011年6月被歐洲藥品局(EMA)和美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療和預(yù)防因溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等細(xì)菌引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病，2016年2月經(jīng)EMA批準(zhǔn)用于治療由胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌引起的豬呼吸道疾病[8-14]。目前我國(guó)已有多家獸藥企業(yè)注冊(cè)申報(bào)該藥，尚未批準(zhǔn)用于國(guó)內(nèi)獸醫(yī)臨床。本論文參照“VICH獸藥靶動(dòng)物安全性研究指導(dǎo)原則概述”[15]和“靶動(dòng)物安全試驗(yàn)指導(dǎo)原則(征求意見稿)”[16]，評(píng)價(jià)了加米霉素注射液對(duì)靶動(dòng)物豬的安全性。

1 材料與方法

1.1 供試藥物 加米霉素注射液(規(guī)格：75g/50 mL；生產(chǎn)批號(hào)：20161225)，由保定冀中生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70日齡大長(zhǎng)二元雜交豬24頭，飼養(yǎng)于經(jīng)嚴(yán)格消毒的豬舍內(nèi)，自由飲水，每頭豬每日喂0.5 kg不添加任何藥物的全價(jià)飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后備用。

1.3 儀器設(shè)備 全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀：XFA6130型，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司生產(chǎn)；全自動(dòng)生化分析儀：日本HITACHI公司生產(chǎn)；組織切片機(jī)：德國(guó)萊卡公司生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 分組 選擇24頭健康二元雜交豬(體重30～35 kg)開展試驗(yàn)，隨機(jī)分為4個(gè)組 (1倍推薦劑量組6 mg/kg·bw，3倍推薦劑量組18 mg/kg·bw，5倍推薦劑量組30 mg/kg·bw，生理鹽水對(duì)照組，給予生理鹽水的體積與5倍劑量組給藥體積一致)，每組6頭豬。連續(xù)給藥3次，分別于試驗(yàn)第0天、第5天和第10天上午8點(diǎn)進(jìn)行肌肉注射。

1.4.2 臨床表現(xiàn) 從首次給藥日至首次給藥后第15天，每日觀察各試驗(yàn)豬的注射部位的變化、精神狀態(tài)、行為表現(xiàn)、排尿排便情況。

1.4.3 平均增重和料肉比 分別在試驗(yàn)開始前和首次給藥后第15天，稱量各試驗(yàn)豬體重并計(jì)算飼料消耗量，求出各組平均增重和料肉比。

1.4.4 血液學(xué)指標(biāo) 分別在給藥前、首次給藥后第5天、首次給藥后第10天和首次給藥后第15天，采集各試驗(yàn)豬的靜脈血于含有抗凝劑的采血管中，進(jìn)行紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)等血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定。

1.4.5 血液生化指標(biāo) 分別在給藥前、首次給藥后第5天、首次給藥后第10天和首次給藥后第15天，采集各試驗(yàn)豬的靜脈血，將新鮮血液置于37 ℃溫育箱孵育30 min，3 000 r/min低溫離心15 min，小心吸取上層血清，放于-80 ℃保存。進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、膽紅素等血液生化指標(biāo)測(cè)定。

1.4.6 病理剖檢和病理組織學(xué) 試驗(yàn)結(jié)束后，將空白對(duì)照組和5倍推薦劑量組全部豬只進(jìn)行剖檢，眼觀各重要臟器病變情況，并采集心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、十二指腸、空腸、回腸等組織做切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和χ2(卡方)檢驗(yàn)分析各組之間的平均日增重、料肉比、血液生理生化指標(biāo)的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn) 試驗(yàn)期間，各組試驗(yàn)豬精神狀況良好，飲水采食正常，排便排尿正常，注射部位無異常，無不良反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)中毒和死亡個(gè)體。

2.2 平均增重與料肉比 計(jì)算各組試驗(yàn)豬的平均初重、平均終重及平均日增重，根據(jù)平均日采食量計(jì)算料肉比。整個(gè)試驗(yàn)期間藥物對(duì)豬體重增加無明顯影響，三個(gè)試驗(yàn)組豬的體重隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

2.3 血液學(xué)指標(biāo) 在給藥前、給藥后第5天、給藥后第10天和給藥后第15天經(jīng)前腔靜脈采集的抗凝血測(cè)定血紅蛋白、紅細(xì)胞、紅細(xì)胞平均體積、平均血紅蛋白含量、白細(xì)胞、血小板數(shù)和淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)7項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果表明，1倍推薦劑量組、3倍推薦劑量組及5倍推薦劑量組豬在給藥后血液學(xué)指標(biāo)均在正常參考值范圍[17]內(nèi)，且與對(duì)空白對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 血清生化指標(biāo) 在給藥前、給藥后第5天、給藥后第10天和給藥后第15天經(jīng)前腔靜脈采集非抗凝血，分離血清后測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血尿素氮、總膽固醇、總膽紅素、總蛋白、白蛋白、球蛋白、堿性磷酸酶和肌酐10項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果顯示，1倍推薦劑量組、3倍推薦劑量組及5倍推薦劑量組豬在不同時(shí)間段的血清生化學(xué)指標(biāo)變化均在正常參考值范圍內(nèi)，與空白對(duì)照組結(jié)果相比無顯著差異(P>0.05)。

2.5 病理組織學(xué)檢查 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將5倍推薦劑量組和空白對(duì)照組全部豬只剖殺，肉眼進(jìn)行系統(tǒng)的解剖學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)異常的病理變化。5倍推薦劑量組與空白對(duì)照組豬只的臟器表面無出血點(diǎn)或壞死病癥，說明5倍推薦劑量組豬連續(xù)給藥3次對(duì)豬的臟器無肉眼可見的不良影響。

將從剖殺豬只采集的心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾、淋巴結(jié)、胃、十二指腸、空腸、回腸等種組織通過H.E.染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。H.E.染色的結(jié)果顯示，5倍推薦劑量組各組織與對(duì)空白照組均未觀察到可見的組織病理學(xué)變化。

3 討論

本試驗(yàn)從臨床觀察、增重和料肉比、血液學(xué)指標(biāo)、血清生化學(xué)指標(biāo)、病理組織學(xué)檢查等方面，系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了加米霉素注射液在1倍推薦劑量、3倍推薦劑量、5倍推薦劑量連續(xù)給藥3次后對(duì)靶動(dòng)物豬的安全性。試驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量組的豬只未產(chǎn)生明顯臨床癥狀，臨床表現(xiàn)與空白對(duì)照組相似。增重、血液學(xué)指標(biāo)、血清生理學(xué)指標(biāo)以及病理組織學(xué)檢查的變化均在正常參考值范圍內(nèi)，且與空白對(duì)照組相比無顯著差異。由此可見，加米霉素注射液以1倍、3倍、5倍推薦劑量作用于靶動(dòng)物豬未產(chǎn)生明顯不良影響。本試驗(yàn)表明，加米霉素注射液以5倍推薦劑量經(jīng)肌肉注射連續(xù)給藥3次對(duì)靶動(dòng)物豬是安全的，加米霉素在臨床應(yīng)用方面具有較高的安全性。