血清miR-126-5p檢測在肺癌診治中的臨床價值*

陳艷敏 黃江浩 劉平 於艷霞 韋淑嫻 葉佐婉

(廣州醫科大學附屬深圳沙井醫院，廣東 深圳 518104)

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一[1],目前肺癌病死率約是40年前的10倍,已成為病死率最高的腫瘤疾病[2]，肺癌每年約160萬新增病例、130萬死亡病例[3]。肺癌的早期診斷是提高患者治愈率和降低病死率的關鍵，大量研究發現miRNA在動物、植物及病毒中廣泛存在，并且參加了細胞分化、增殖、凋亡、代謝、腫瘤發生及轉移等多項生命活動[4，5],隨著人們對微小RNA研究的深入，已有大量文獻報道miRNA基因作為腫瘤標志物可作肺癌診斷,腫瘤標志物對肺癌的早期診斷以及療效判斷與監測有一定的臨床意義]。血清中miR-126-5p是體內重要的微小RNA基因，研究發現，miR-126對于心血管系統特異性最高，對于胚胎組織、呼吸系統、造血系統等也有較高特異性[6]，Shen等[7]鑒定出了在早期非小細胞肺癌中異常表達的12種miRNAs，其中miR-21、 miR-126、miR-210、miR-486-5p用于區分NSCLC患者與健康者的的敏感性及特異性分別為86%、97%，其肺癌患者血清中高表達及較高的靈敏度和特異度的特點對肺癌診斷有較大臨床價值,可作為肺癌早期診斷的腫瘤標志物。

1 資料與方法

1.1 本文資料為55例肺癌患者組和包括21例健康對照者及32例肺部良性疾病患者的非肺癌組。本項目完成的前提是收集到大規模的合格標本，在病人知情同意下，我們在本院和廣州醫科大學呼吸疾病研究所收集標本，挑選未經治療且處于疾病I/II期的新發病例，經病理學確診的肺癌患者為肺癌組，病人入選標準包括疾病局限于胸部，沒有遠端轉移的證據，排除高血壓、心血管疾病及糖尿病疾患。 ①肺癌組患者55例，男性31例，女性24例，平均年齡60.71歲，中位數60歲。②非肺癌組患者53例，男性24例，女性29例，平均年齡57歲，中位數53歲。非肺癌組中包括健康對照者(A亞組)21例和(B亞組)中的32例肺部其他疾病患者(肺部感染、結核性胸膜炎、肺結核、慢性阻塞性肺疾病、矽肺等)。標本采集前一年內沒有外科手術史和放射治療史，病例至少跟蹤隨訪兩年。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有受檢對象均于早晨6：00～9：00空腹用EDTA抗凝管靜脈采血5 ml并混勻抗凝，30min內于4 ℃，3000 r/min離心10 min分離血清，上層血漿分裝至 1.0 ml冷凍管,每管0.5 ml,置-80 ℃貯存備用。

1.2.2 miRNA提取用miReasy Mini Kit試劑(Qiagen德國)提取血漿中的miRNA。主要步驟如下：①向400 ul血漿中加入5倍體積的QIAzol試劑，室溫放置5 min。②加入等體積100 %氯仿，放置2～3 min。③4 ℃、12000 r/min離心15 min后將離心機調至室溫。④ 取上層水相300 ul，加入1.5倍體積100 %乙醇，充分混勻。⑤將混合液依次轉移至RNeasy Mini spin column柱子中，12000 r/min室溫下離心15 s，棄廢液。⑥加700 ul Buffer RWT，離心 (同上)，棄廢液。⑦加500 ul RPE，離心 (同上)，棄廢液。⑧重復步驟7。⑨換新2ml 收集管，空轉2min。⑩用30ul的RNease-free water溶解RNA。置于-70℃低溫冰箱備用。為將RNA提取效率及PCR數據標準化,在每個提取標本中加入25飛摩爾的合成線蟲miR-54(Cel-miR-54)。

1.2.3 RT-qPCR檢測 應用miScript Reverse Transcription Kit 試劑(Qiagen德國，part No：4440044)于普通PCR儀(上海宏石 SLAN-96P)上進行miRNA的逆轉錄。由于血清中miRNA的濃度較低，按照試劑盒說明書，取15 ul模板RNA+4 ul Buffer RT+1 ul Mix，反應體系為20 ul，反應條件為：37 ℃、1 h，95 ℃、5 min。qPCR(美國ABI step one plus)反應采用miScript SYBR Green PCR Kit 試劑盒(Qiagen，德國,lot No：1507052)，按照試劑盒說明書依次加入反應所需的cDNA模板和試劑:①1ul cDNA+0.4ulmiRNA特異性引物+10ul Mix+2ul UP+6.6ul H2O；②1ul cDNA+0.4ul U6F/R+10ul Mix+8.2ul H2O。反應體系均為20ul。反應條件為：95℃、15min，94℃、30s，55℃、15s，70℃、30s，設置2個重復孔，40個循環結束。反應在qPCR儀上進行(ABI step one plus)。

1.2.4 分析定量PCR數 應用RT-qPCR技術檢測肺癌血漿中miR-126-5p的表達水平。miR-126-5p為目的基因，miR-Cel-54作為內參基因作數據的標準化處理。目的基因的相對表達量(Re)應用2-△CT公式進行計算，△CTc=CTc目-CTc內，△CTn=CTn目-CTn內。對目的基因的相對表達量進行對數處理后(log2Re=-△CT)。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析miR-126-5p在組間的分布差異。P<0.05 為有統計學差異。采用ROC曲線分析指標的診斷靈敏度和特異性，通過檢測結果作圖繪成ROC曲線。

2 結果

2.1 肺癌組與非肺癌組血清miR-126-5p檢測結果比較 肺癌組樣本檢驗的均值(△CT)為-1.30，標準差為2.18；非肺癌組樣本檢驗的均值(△CT)為1.17，標準差為4.08。兩組間的-△△CT為2.48。miR-126-5p在肺癌組的含量是非肺癌組的倍數FC為5.57，FC>1，見表1。

表1 肺癌組與非肺癌組血清miR-126-5p檢測結果比較Table 1 The serum miR-126-5p

注：-ΔΔCT=ΔCTGROUPN-ΔCTGROUPC

2.2 miR-3405p腫瘤標志物在各組血清中的表達及相關統計學指標 方差方程的Levene檢驗及均值方程的t檢驗均顯示，miR-126-5p在肺癌組與非肺癌組之間的差異有統計學意義〔(F=14.81P<0.001)，(t=-3.91P<0.001)〕；方差方程的Levene檢驗和均值方程的t檢驗均顯示，miR-126-5p在非肺癌組中的健康人(A亞組)和肺部良性疾病(B亞組)之間的差異均無統計學意義〔(F=1.12P>0.05),(t=-1.314P>0.05)〕，見表2。

表2miR-126-5p腫瘤標志物在各組血清中的表達及相關統計學指標

Table2miR-126-5pserumtumormarkersandtherelatedstatisticalindicators

組別相關統計學指標FPtdfP(雙側)肺癌組與非肺癌組14810?3917890A亞組與B亞組 1120097?131476080106

2.3 miR-126-5p的相對表達量、靈敏度、特異度在肺癌中的診斷價值 用ROC曲線來評價miR-126-5p的相對表達量在肺癌的診斷價值，相對表達量曲線下面積AUC為0.666，漸近 95% 置信區間為0.563～0.768，漸進Sig.b為0，差異具有統計學意義(P<0.001)，表明診斷價值較高(見表3圖1)；miR-126-5p對肺癌診斷的靈敏度為66.1 %，特異度為71.7 %，診斷臨界值為12.25。

表3miR-126-5p的相對表達量、靈敏度、特異度在肺癌的診斷價值評價

Table3Thesensitivity,relativeexpressionofspecificevaluationofmiR-126-5pinthediagnosticvalueoflungcancer

指標ROC曲線下面積漸近95%區間靈敏度(x10?2)特異度(x10?2)miR?126?5p06660563～0768661717

圖1 miR-126-5pROC曲線圖Figure 1 miR-126-5 proc plot

2.4 肺癌組與非肺癌組的檢測結果在年齡、性別上均無統計學意義(P>0.05)(P=0.103、P=0.338)。

3 討論

RNA是長度約為19～25bp的非編碼基因的大家族，miRNAs在循環血液中可穩定存在，能夠耐受高溫、強酸、強堿等多種極端條件[8,9]，在基因表達中起著調控作用，其表達量隨腫瘤疾病的發生發展而變化，已有研究報道與多種腫瘤疾病相關，如肺癌[10]、胃癌[11]等。miRNA廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡、應急反應、免疫反應等多種生命活動過程，作為癌基因或抑癌基因對腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲、轉移以及血管生成的調節發揮著重要作用，Wang XC等[12]研究發現，miR-126通過P13k的-AKT途徑對擴散的非小細胞肺癌癌細胞進行調控，引起凋亡。腫瘤相關miR在腫瘤疾病發生發展過程中穩定存在于血液中，有研究發現miRNAs可以調節原癌基因和抑癌基因的表達[13]，在腫瘤研究領域，miRNA已被用于癌癥的分段[14], 有研究表明[15，16，17]，miR-126通過對其靶基因的調節調控細胞增殖、分化和凋亡，參與了腫瘤的發生、侵龔和轉移，在細胞的生長發育、癌變等生命過程中，通過作用多種靶基因而在腫瘤發生發展過程起著非常重要的作用 ，其在肺癌的發生發展中的重要作用，可能成為肺癌治療的可選靶點之一。還有研究表明，肺癌等疾病中有miRNA表達變化[18]，miR-126濃度對非小細胞肺癌診斷有一定的診斷臨床意義[19]，因而可用于腫瘤疾病的診斷。目前通過miRNA芯片雜交方法許多惡性腫瘤的miRNA表達譜得以建立，其中一些miRNA成為腫瘤治療的新的靶點并成為臨床患者預后的腫瘤標志物。miRNA對肺癌疾病的診斷價值，已引起人們的廣泛關注，目前已報道的miRNA對肺癌的診斷價值不一，為進一步研究提供了依據。

近幾年,由于各種原因,多種腫瘤發病率明顯增加,很多腫瘤患者直至疾病晚期才確診,大多數腫瘤現在仍無有效的治療方法,總體生存率較低[20，21 22]。有研究證實[23，24，]，腫瘤患者血清或血漿游離出的miRNA，成為很有價值的腫瘤檢測指標，而且miRNA在血清呈穩定狀態易于被檢測。本研究結果顯示，miR-126-5p在肺癌患者組的含量是非肺癌患者組的倍數FC為5.57, 表明其在肺癌患者組是高表達.肺癌患者血清中的miR-126-5p水平明顯高于非肺癌患者，表明miR-126-5p可作為診斷肺癌較為理想的指標。miR-126 ROC曲線下面積AUC為0.666,靈敏度，特異性均較高(66.1 %和71.7 %)，表明其對肺癌有中度的診斷能力和較高的排出其他疾病的能力,有望成為新的腫瘤標志物.健康對照組與肺良性疾病組血清miR-126-5p水平無差異，表明其對肺部良性病變診斷無臨床意義。肺癌組與非肺癌組的檢測結果在年齡、性別上均無差別，表明本次實驗肺癌與年齡、性別不存在相關性，與文獻報道[19]相一致。此研究國內外尚無報道，于是我們進行了本課題的研究，經多方努力，確認本研究實驗有較大的臨床價值。

4 結論

應用RT-qPCR技術，對血液中miR-126-5p腫瘤標志物分析，本實驗提示miR-126-5p對肺癌有一定診斷價值，在肺癌確診尚無理想方案的情況下，miR-126-5p可作為一個參考指標，但miR-126-5p在腫瘤發病機制中的作用及其靶基因功能尚需深入研究,盡可能標化檢測方案和參考范圍，為腫瘤診斷提供新的突破口。

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