4株H5N6亞型禽流感病毒毒株的分離鑒定與致病性研究

周佩嬌，邢 利，賈偉新，廖 明*

(1.華南農業大學獸醫學院，人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室，農業部人畜共患病重點實驗室，農業部獸用疫苗創制重點實驗室，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣州 510640；2. 廣州市南沙區動物防疫監督所，廣州 511458)

禽流感(avian influenza)是由A型流感病毒引起的禽類(家禽和野禽)的感染和/或疾病綜合征[1]。禽流感病毒感染、非家禽的鳥類包括野生鳥類高致病性A型流感病毒感染被世界動物衛生組織(OIE)列為法定報告疫病[2]。高致病性禽流感臨床癥狀主要表現為采食量下降、雞冠發紺、產蛋率下降、精神萎靡、呼吸困難等，剖檢常見腺胃、肌胃角膜出血[3]。流行特征主要為潛伏期短，傳播快，發病急，死亡率可達100%，同時可引起人感染發病，甚至死亡，因此備受關注。H5N6亞型禽流感病毒曾以低致病性形式在大部分國家的禽類中存在。現在情況已發生變化，監測數據顯示，目前在我國南方地區H5N6亞型禽流感病毒監測到的比例增大，禽類、野鳥和活禽市場中都曾分離到，毒株的致病力有逐漸增強的趨勢[4-5]。2014年8月23日，黑龍江省哈爾濱市首次發生了鵝感染H5N6禽流感疫情[6]。2015年4月，香港首次從野鳥中檢測出H5N6亞型禽流感病毒[7]。根據農業部疫情發布數據統計，2010年1月至2017年7月，我國共發生禽流感疫情37起，H5N6亞型禽流感疫情占到疫情發生數的76.2%，H5N6已取代H5N1成為禽流感病毒優勢流行亞型，發生省份或自治區包括湖南、湖北、新疆、四川、甘肅、貴州、廣東、江蘇等地，呈全國范圍流行。2014年5月7日，四川省出現了全球首例人感染H5N6亞型禽流感病毒致死病例，H5N6亞型禽流感也跨越了宿主屏障，對人類健康安全造成了威脅[8]。

新型優勢毒株的出現和流行趨勢的變化引發了廣泛的關注。研究顯示，新型H5N6亞型禽流感病毒可能是通過抗原轉變的變異方式，由H5N1亞型禽流感病毒與H6N6亞型禽流感病毒重組而來，毒力更強、傳播更快、發病率和死亡率更高[9]。近年來流行的H5N6亞型禽流感病毒作為一種新型流感病毒，其進化機制、流行趨勢和致病性尚不明晰，需要密切監測、系統和深入的研究與分析。

本研究對2015—2016年廣東臨床送檢的病料進行病毒分離鑒定，得到4株H5N6亞型禽流感病毒，通過點眼滴鼻方式攻毒，研究其對SPF雞的致病性，為禽流感的防控提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與實驗動物

總RNA抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Magen公司；反轉錄酶、ExTaq聚合酶、DL1000 Marker、DL2000 Marker等購自TaKaRa公司；隨機引物、反轉錄引物、PCR擴增引物購自廣州艾基生物有限公司；9～11日齡的SPF雞胚購于廣東大華農動物保健品有限公司；4周齡SPF雞購于新興大華農SPF實驗動物中心。

1.2 試驗樣品

2015—2016年湛江、惠州、清遠等地臨床送檢樣品，由人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室保存。

1.3 病毒分離與鑒定

臨床病料稱重研磨后，按1 g·mL-1加入PBS，凍融3次，10 000 r·min-1離心3 min，取上清接種。每個樣品接種3枚9～11日齡SPF雞胚。每隔12 h照胚，將死亡雞胚4 ℃保存，收取含有病毒的尿囊液，48 h后通過HA/HI試驗鑒定禽流感病毒的HA亞型。抽提病毒RNA。

1.4 基因測序及進化分析

利用各基因特異性引物(表1)進行PCR擴增、純化，純化產物克隆到pMD18-T載體上,陽性克隆送廣州艾基生物技術有限公司進行測序。用NCBI Blast進行序列比對；用MEGA6.06軟件進行進化樹分析；用NetNGlyc 1.0 Server分析序列糖基化位點。

1.5 雞胚半數感染量(EID50)測定

尿囊液按照10倍稀釋法稀釋成10-5～10-95個稀釋度，每個稀釋度各接種5枚9～11日齡非免疫胚，0.2 mL·枚-1，37 ℃培養，棄去12 h內死亡雞胚，12 h后死亡雞胚放入4 ℃中保存，48 h后測定所有感染雞胚的尿囊液血凝活性，來判斷該雞胚是否被感染。通過Reed-Muench法計算病毒EID50。

表1擴增引物

Table1Primesusedforamplification

引物名稱Primername上游引物(5'→3')Forwardprimer下游引物(5'→3')ReverseprimerPB11AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTGAAGAGGATTGGAGYCCRTCCCACCAPB12ATGATGATGGGCATGTTCAACATGAGTAGAAACAAGGCATTTTTTCAPB21AGCRAAAGCAGGTCAAWTATATTCAACTGCYTTTATCATGCAMTCYTCPB22GCAACRGCTATYYTRAGGAAAGCAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAPA1AGCRAAAGCAGGTACTGATYCAAAAATCCARCTYGARTCWGTCAATTCPA2TAAGCAGGTGCTGGCAGAAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGAHA5AGCRAAAGCAGGGGTHAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAANPAGCRAAAGCAGGGTAGATAATCAAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTNA6AGCAAAAGCAGGGTGAAAATGAGTAGAAACAAGGGTGTTTTMAGCAAAAGCAGGTAGATRTTKAAAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTCNSATTAGCAAAAGCAGGGTGGAGTAGAAACAAGGGTGTT

1.6 對SPF雞致病性試驗及同居試驗

將4周齡SPF雞隨機分為4組，每組12只(攻毒組6只，同居組6只)，另設一組空白對照組(6只)，每只雞戴上腳標登記編號。攻毒組每只雞經點眼、滴鼻方法接種105EID50200 μL病毒尿囊液，同居組和空白對照組不攻毒，隨后連續觀察9 d，并隨時記錄各組雞的臨床癥狀和雞的死亡情況。飼養期間分別于感染后3、5、7、9 d采集各組雞的咽、肛拭子，用含有青霉素與鏈霉素各5 000 IU的PBS緩沖液振蕩，各接種3枚9～11日齡的非免疫胚，37 ℃孵化，48 h后測定雞胚尿囊液的血凝活性，判斷是否存在病毒感染。

在攻毒后4 d隨機剖殺攻毒組和對照組雞，無菌采取心、肝、脾、肺、腎、腦6種組織，用含有5 000 IU雙抗的無菌PBS液倍比稀釋成10-1～10-77個稀釋度接胚，測定病毒感染SPF雞后各個組織臟器中病毒復制能力。

1.7 病理組織學觀察

在攻毒后4 d隨機剖殺攻毒組、同居組和對照組雞，分別取心、肝、脾、肺、腎、腦6種組織，用甲醛浸泡固定，送武漢賽維爾生物科技有限公司進行病理切片分析。

2 結 果

2.1 病毒分離

2015—2016年臨床樣品共分離到4株H5N6亞型禽流感病毒(表2)。

2.2 遺傳序列分析

基因序列分析結果顯示，分離株HA基因相似性在95.4%～97.1%之間，HA基因位于Clade2.3.4.4(圖1)，NA基因屬于歐亞分支(圖2)。

表2H5N6亞型禽流感病毒分離株

Table2IsolatesofH5N6subtypeAIV

毒株Strain序列號Serialnumber宿主來源Hostsource采樣地點Samplingposition亞型Subtype采樣時間Samplingtime15577EPI_ISL_278025鴨湛江H5N62015-07-0316274EPI_ISL_278026雞惠州H5N62016-03-0116875EPI_ISL_278027鵝清遠H5N62016-08-2916887EPI_ISL_278031鵪鶉湛江H5N62016-08-15

圖1 HA基因遺傳序列分析Fig.1 Phylogenetic analysis of HA gene

圖2 NA基因遺傳序列分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NA gene

2.3 氨基酸序列分析與關鍵位點分析

HA氨基酸序列分析結果表明，HA基因編碼567個氨基酸，具有8個潛在糖基化位點(表3)。HA蛋白的裂解位點處具有多個連續堿性氨基酸，符合高致病性禽流感病毒分子特征。NA基因編碼459個氨基酸，具有6～7個潛在糖基化位點(表4)。HA基因編碼HA受體結合位點存在S137A突變；NA蛋白相應位點沒有改變；PB1蛋白的L13P位點、PA蛋白的N615K位點、NP蛋白的A184K位點和NS1蛋白的D92E位點發生改變(表5)。

表3HA蛋白潛在糖基化位點

Table3PotentialglycosylationsitesofHAproteins

毒株Strain潛在糖基化位點Potentialglycosylationsites1557726NNS2827NST2939NVT41181NNT183209NPT211302NSS304499NGT501558NGS5601627426NNS2827NST2939NVT41181NNT183209NPT211302NSS304499NGT501558NGS5601687526NNS2827NST2939NVT41181NNT183209NPT211302NSS304499NGT501558NGS5601688726NNS2827NST2939NVT41181NNT183209NPT211302NSS304499NGT501558NGS560

表4NA蛋白潛在糖基化位點

Table4PotentialglycosylationsitesofNAproteins

毒株Strain潛在糖基化位點Potentialglycosylationsites1557751NET5354NPT5659NIT6175NLT77135NGT137190NAS192391NWS3931627451NET5354NPT5659NIT61-135NGT137190NAS192391NWS3931687551NET5354NPT5659NIT61-135NGT137190NAS192391NWS3931688751NET5354NPT5659NIT61-135NGT137190NAS192391NWS393

表5重要位點分析

Table5Genelocusanalysis

病毒蛋白質Viralprotein毒株Strain15577162741687516887HAS137AS137AS137AS137APB1L13PL13PL13PL13PPAN615KN615KN615KN615KNPA184KA184KA184KA184KNS1D92ED92ED92ED92E

2.4 雞胚半數感染量測定

試驗中所有感染病毒的雞胚都在12～24 h死亡，病毒EID50結果如表6。

2.5 對SPF雞致病性

SPF雞的致病性試驗結果發現，攻毒后第2天，16274、16875和16887攻毒組全部死亡，同居組到第3天死亡率達50%以上。15577攻毒組至第5天全部死亡，同居組第9天全部死亡。對照組無雞死亡(表7)。

表6雞胚半數感染量

Table650%embryoinfectiondose

毒株Strain稀釋度Dilution10-510-610-710-810-9EID50/200μL155775/55/54/50/50/5107.38162745/53/50/50/50/5106.17168755/53/51/50/50/5106.25168875/55/53/50/50/5107.17

2.6 SPF雞感染后各組織臟器含毒量測定情況

15577攻毒組死亡的雞腦和肺中病毒滴度較其他臟器高，lg EID50·200 μL-1值大于4.50，而心和腎的病毒滴度較低，為2.25～2.75。16274攻毒組死亡的雞肺和肝中病毒滴度較其他臟器高些，lg EID50·200 μL-1平均值分別為6.13和5.00，心和腎病毒滴度相對低些，為3.88、3.50。16875和16887攻毒組死亡的雞6個臟器中病毒滴度值差距不大，病毒滴度都在4.5左右。空白對照組沒有檢測到病毒滴度(圖3)。

表7試驗雞死亡情況(n=6)

Table 7 The death of chicken (n=6) 只

圖3 雞臟器中禽流感病毒滴度Fig.3 The titer of avian influenza virus in chicken viscera

2.7 SPF雞感染后拭子檢測情況

15577組的攻毒組和同居組第3天開始都能分到病毒，一直到第9天雞死亡為止；其余各攻毒組第2天雞全部死亡，咽、腔拭子無數據；同居組除了16875組咽拭子沒檢測到病毒外，其余同居組從第3天咽、腔拭子均分離出病毒；空白對照組所有咽、腔拭子都分離不出AIV(表8)。

2.8 SPF雞感染后各組織臟器病理變化

病理切片結果發現，病毒對雞的肺組織、肝組織、腦組織、脾組織、腎組織和心肌造成了廣泛性的損傷。主要的病變：肺和腎充血、出血；肝細胞壞死，淋巴細胞浸潤；腦組織壞死，神經膠質細胞增生；脾細胞壞死、減少；心肌纖維壞死、充血(圖4～9)。

3 討 論

禽流感病毒為RNA病毒，有8個片段，RNA酶的復制精確程度比不上DNA酶，存在較多突變，有些突變能增強病毒的感染力，有些突變則是減弱病毒的毒力。有些單一突變能增強病毒的繁殖力和致病力，有些致病力改變需要多片段、多位點共同突變完成，是一個協調作用的過程。總體而言，本研究中的禽流感病毒分離株有多基因片段發生了突變，如PB1的L13P、PA的N615K，NP的A184K、NS的D92E等，導致了禽流感病毒毒力的增強[10-13]。有研究顯示HA的Q226L、G228S雙位點突變，PB2的E627K、Q591K和D701N突變，NS的G540A獨特突變等，可增強病毒在哺乳動物細胞的感染和繁殖能力[14-16]。這些突變在本研究中未發現。

表8拭子的病毒分離情況

Table8Thevirusisolationfromswab

毒株及分組Strainandgroup咽拭子Pharynxswabs泄殖腔拭子Cloacalswabs第3天Day3第5天Day5第7天Day7第9天Day9第3天Day3第5天Day5第7天Day7第9天Day915577攻毒組Attackgroup8/9///3/9///同居組Cohabitinggroup9/1812/186/129/125/1812/185/127/1216274攻毒組Attackgroup////////同居組Cohabitinggroup2/3///3/3///16875攻毒組Attackgroup////////同居組Cohabitinggroup0/90/3//4/91/3//16887攻毒組Attackgroup////////同居組Cohabitinggroup1/31/33/3/3/31/32/3/空白對照組Blankcontrolgroup0/60/60/60/60/60/60/60/6

A.空白對照組；B.感染組，腦組織局灶性壞死(黑色箭頭所示)，神經元細胞大量減少至消失，壞死灶周圍膠質細胞(紅色箭頭所示)增多；C.感染組，部分神經元水腫，細胞質呈空泡化(黑色箭頭所示)A. Blank group; B. Infection group, focal necrosis (indicate by the black arrow), neuronal cells decreased greatly and glial cells increased around the necrotic area (indicate by the red arrow); C. Infection group, some of the neurons are edematous and the cytoplasm was vacuolated (indicate by the black arrow)圖4 腦組織病理切片結果(260×)Fig.4 The pathological results of brain (260×)

A.空白對照組；B.感染組，肝竇擴張淤血，肝竇中充滿大量紅細胞(黑色箭頭所示)，可見大量肝細胞水腫至氣球樣變，細胞質呈空泡化(紅色箭頭所示)，肝細胞點狀壞死(黃色箭頭所示)；C.感染組，可見少量淋巴細胞浸潤(黑色箭頭所示)A. Blank group; B. Infection group, hepatic sinus dilation and congestion, and the sinus is full of red blood cells (indicate by the black arrow), a large amount of liver cells are edema to ballooning, cytoplasm vacuolation (indicate by the red arrow), liver cells are necrosis (indicate by the yellow arrow); C. Infection group, a small amount of lymphocytic infiltrates can be seen (indicate by the black arrow)圖5 肝組織病理切片結果(260×)Fig.5 The pathological results of liver (260×)

A.空白對照組；B.感染組，肺靜脈擴張淤血，血管內大量紅細胞(黑色箭頭所示)，間質輕度水腫，結締組織疏松(紅色箭頭所示)；C.感染組，肺三級支氣管內可見大量炎性滲出物(黑色箭頭所示)，間質可見少量炎性細胞(紅色箭頭所示)；D. 感染組，肺泡上皮細胞點狀壞死(黑色箭頭所示)；E.感染組，局部肺組織大量出血(黑色箭頭所示)A. Blank group; B. Infection group, pulmonary veins dilate, congestion, and a large number of red blood cells in the blood vessels (indicate by the black arrow), interstitial edema is mild and connective tissue is loose (indicate by the red arrow); C. Infection group, a large number of inflammatory exudates are seen in the bronchi of grade three of the lung (indicate by the black arrow), small amounts of inflammatory cells are seen on the stroma (indicate by the red arrow); D. Infection group, alveolar epithelial cells show punctate necrosis (indicate by the black arrow); E. Infection group, local lung tissue bleeds profusely (indicate by the black arrow)圖6 肺組織病理切片結果(260×)Fig.6 The pathological results of lung(260×)

A.空白對照組；B.感染組，腎小球內壞死細胞碎片(黑色箭頭所示)，大量腎小管上皮細胞壞死，細胞核固縮深染或溶解消失(紅色箭頭所示)；C.感染組，腎毛細血管擴張淤血(黑色箭頭所示)，部分腎小管上皮細胞氣球樣變性，細胞質呈空泡化(紅色箭頭所示)A. Blank group; B. Infection group, glomerular necrosis cell debris (indicate by the black arrow), a large number of tubular epithelial cells are necrosis, pyknosis, or staining and dissolution (indicate by the red arrow); C. Infection group, renal telangiectasia and congestion (indicate by the black arrow), partial tubular epithelial cell ballooning, cytoplasm vacuolation (indicate by the red arrow)圖7 腎組織病理切片結果(260×)Fig.7 The pathological results of kidney(260×)

A.空白對照組；B.感染組，脾竇擴張淤血，毛細血管內充滿紅細胞(黑色箭頭所示)，大量脾細胞壞死，壞死細胞核碎裂或溶解消失(紅色箭頭所示)；C.感染組，淋巴細胞減少，巨噬細胞大量增多(黑色箭頭所示)，紅細胞崩解，可見少量含鐵血黃素沉積(紅色箭頭所示)，少量脾細胞壞死，核碎裂(黃色箭頭所示)A. Blank group; B. Infection group, the splenic sinus dilated with congestion and capillaries filled with red blood cells (indicate by the black arrow), a large number of splenic cells are necrotic and necrotic, nuclei fragmented or dissolved (indicate by the red arrow); C. Infection group, the increasing number of macrophages, lymphocytes decreased (indicate by the black arrow), red blood cell disintegrate, a small amount of hemosiderin deposition occurred (indicate by the red arrow), a small amount of spleen cells developed necrosis, nuclear fragmentation (indicate by the yellow arrow)圖8 脾組織病理切片結果(260×)Fig.8 The pathological results of spleen(260×)

A.空白對照組；B.感染組，心肌出血，心肌纖維間可見大量紅細胞并伴有大量含鐵血黃素沉積(黑色箭頭所示)；C.感染組，心肌纖維大量減少，可見壞死心肌細胞(黑色箭頭所示)，膠原纖維大量增生，纖維化(紅色箭頭所示)A. Blank group; B. Infection group, Myocardial hemorrhage, large amounts of red blood cells were found between the fibers of the heart and were accompanied by large amounts of ferric deposits (indicate by the black arrow); C. Infection group, a large decrease in myocardial fibers, necrotic myocardial cells were seen (indicate by the black arrow), Collagen fibers were proliferated and fibrotic (indicate by the red arrow)圖9 心組織病理切片結果(263×)Fig.9 The pathological results of heart(263×)

對SPF雞致病性試驗發現，15577株為2015年分離到的毒株，與2016年分離到的另外3個毒株相比，致死性和水平傳播力稍弱，是否說明廣東H5N6亞型禽流感病毒的毒力在變強，這有待于更多樣本數據的研究。

研究發現，4個毒株在感染雞的心、肝、脾、肺、腎、腦中均檢測到禽流感病毒。其中15577株和16274株病毒肺和腦中病毒滴度最高，心、腎中病毒滴度較低；16875株和16887株病毒比較均衡得存在于6個臟器中，各個臟器組織的病毒滴度都很高，引發嚴重的內臟器官功能障礙，導致機體死亡。在排毒試驗中，雞從開始檢測咽、腔拭子排毒情況到死亡之前都能發現持續不間斷的排毒，其中泄殖腔排毒是重要的排毒方式，所有雞泄殖腔拭子都能檢測到病毒，提示要做好糞便的無害化處理。

禽流感病毒對機體的損傷主要是通過病毒對臟器組織的損傷，引發功能性障礙，最終出現多器官衰竭而死。在H5N6亞型禽流感病毒感染雞的剖殺過程中，發現有腦的皮下出血、心包炎、心肌壞死、肝壞死等癥狀。病理切片可觀察到禽流感病毒感染雞的肺和腎充血、出血；肝細胞壞死，淋巴細胞浸潤；腦組織壞死，神經膠質細胞增生；脾細胞壞死、減少；心肌纖維壞死、充血等組織學病變。

4 結 論

從廣東省臨床病料中分離到4株H5N6亞型禽流感病毒，遺傳序列分析結果表明，分離株HA基因位于2.3.4.4分支，HA蛋白裂解位點具有連續堿性氨基酸序列，屬于高致病禽流感病毒。SPF雞的致病性試驗表明，4株禽流感病毒對SPF雞具有高致病性，致死率為100%，具有致死快、死亡率高的特點。因此，建議加強對H5N6亞型禽流感的監測與防控，嚴防禽流感疫情的發生。

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