猴頭菇多糖對氧化應激狀態下仔豬回腸形態結構及通透性的影響

張建龍，丘富安，董 星，秦 韜，馬玉芳，黃一帆*，李 健*

(1. 福建農林大學 福建省獸醫中藥與動物保健重點實驗室，福州 350002；2. 中西獸醫結合與動物保健福建省高等學校重點實驗室，福州 350002)

氧化應激作為誘發多種疾病的重要病理機制之一，導致畜禽生長緩慢、體重下降、飼料利用率低，幼齡畜禽出現發育不良、腹瀉、腸道絨毛萎縮和隱窩增生、成活率低下等情況，對畜禽養殖產生巨大影響。研究表明，中藥多糖作為免疫添加劑，對免疫系統具有廣泛的調節作用[1-3]。

人工誘發氧化應激是一種常見的試驗方法，常用的有大腸桿菌、沙門菌與高溫滅活的葡萄球菌三種氧化應激原，其中大腸桿菌是使用最普遍的一種菌種，具體模型的建立是在試驗豬腹膜或者靜脈注射一定劑量的大腸桿菌脂多糖(LPS)。脂多糖(LPS)是存在于革蘭陰性菌細胞壁中的致病成分，已有眾多研究使用LPS構建細胞[4-6]和動物[7-8]的氧化應激模型。LPS既可以誘導產生大量的ROS，又是生豬氧化應激繼發內毒血癥過程中重要的毒力因子，因此更具生產實際意義。

猴頭菇(Hericiumerinaceus)是一種藥用食用菌，具有抗氧化、抗衰老、保肝利肝、提高免疫力等的功效[9-11]，因為大量的人工栽培使得其成本降低，在日常食品中深受青睞。猴頭菇多糖(Hericiumerinaceuspolysaccharide，HEP)作為猴頭菇內的主要活性物質，在動物保健和治療上有著良好的療效。然而，用HEP對豬腸道氧化應激的研究目前還比較鮮少，因此，本試驗利用LPS建立氧化應激模型，來探究HEP對豬腸道氧化應激作用的各方面影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選購45頭健康的(28±3)日齡斷奶仔豬(杜洛克×長白×大白)，猴頭菇多糖(HEP)：購自上海康舟真菌多糖有限公司，純度為50%，脂多糖(LPS)：大腸桿菌血清型055：B5，Sigma公司提供，qPCR試劑盒和反轉錄試劑盒由TaKaRa公司提供。其他試劑還有蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(cwbiotech 02912E)、蛋白marker(Biomed)、PVDF膜0.45 μm(Millipore)、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺(Amresco)、SDS(Sigma L4390)、HRP標記山羊抗兔一抗(Jackson111-035-003)、HRP標記山羊抗鼠二抗(Jackson115-035-003)等。

1.2 試驗仔豬分組及處理

將45頭仔豬按體重相近原則隨機分為5個處理組：空白組、模型組(LPS)、0.2% HEP組、0.4% HEP組、0.6% HEP組，分別飼喂基礎日糧、基礎日糧、添加0.2%、0.4%、0.6% HEP的基礎日糧。每個處理組9個重復，每個重復1頭仔豬，試驗周期21 d。第21天，分別對模型組、0.2% HEP組、0.4% HEP組、0.6% HEP組仔豬腹腔注射100 μg·kg-1BW脂多糖(LPS)，空白組注射等劑量滅菌生理鹽水(NS)。試驗于福建莆田優利可農牧發展有限公司進行，每天喂食3次，單欄飼養，圈舍自然通風，且不定期進行消毒。

1.3 樣品采集

注射LPS后第3小時，每個處理組隨機挑選3頭試驗豬，前腔靜脈采血15 mL左右，2 000 r·min-1離心20 min分離血清，用于檢測抗氧化指標以及谷氨酰胺和二胺氧化酶。試驗豬于采血完成后立即宰殺，從腹腔內取3～5 cm的回腸；取部分腸組織置于10%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定，用于制作切片；另取部分腸組織置于液氮中凍存，用于檢測緊密連接相關基因和蛋白質的表達情況。

1.4 HEP對氧化應激仔豬血清抗氧化指標的影響

過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒(比色法)、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)，購自南京建成生物工程研究所，采用分光光度法測定，詳細步驟參照試劑盒說明書要求完成。

1.5 HEP對氧化應激仔豬腸血清GLN含量和DAO活性的影響

谷氨酰胺(GLN)試劑盒和二胺氧化酶(DAO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，采用改良分光光度法，按試劑盒說明測定回腸中谷氨酰胺(GLN)和二胺氧化酶(DAO)活性。

1.6 HEP對氧化應激仔豬回腸形態結構的影響

將保存在4%多聚甲醛的小腸組織經過“浸洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烘干→脫蠟入水”制備石蠟切片后，通過蘇木精-伊紅(HE)染色。每張切片選取2個視野，每個視野連續測定10 根腸絨毛，運用Imageproplus6.0軟件計算腸絨毛高度和隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.7 HEP對氧化應激仔豬回腸緊密連接的影響

1.7.1 RNA提取和反轉錄 RNA的提取按照組織勻漿研磨的方法，將提取出的總RNA溶于DEPC水中測定其OD值，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間的說明其純度相對較高，經PCR反應擴增后取8 μL·孔-1的PCR反應液進行瓊脂凝膠電泳試驗。

1.7.2 RT-PCR測定 根據GenBank中豬源Occludin、Claudin和ZO-1全長序列，用Oligo 7.0軟件設計引物，內參基因為GAPDH，按試劑盒說明書要求，采用12.5 μL的體系，將反應液加到Real Time PCR管內進行Real Time PCR反應，循環參數：98 ℃ 2 min 初期變性；98 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、68 ℃ 30 s，40 個循環。采用雙△Ct+標準曲線擴增效率校正法，用10倍梯度稀釋法制作標準曲線，每個樣品3個重復，計算公式為相對表達量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

表1基因的擴增引物序列

Table1Geneamplificationprimersequence

基因Gene引物序列(5'→3')Primersequence產物長度/bpLengthofproducts登錄號AccessionNo.GAPDHForward:ACATCATCCCTGCTTCTACTGGReversed:CTCGGACGCCTGCTTCAC188AF017079OccludinForward:ACGAGCAGCAAAGGGATTCTTCReversed:TCACACCCAGGATAGCACTCATT152NM_001163647.2ClaudinForward:TGCCTCAGTGGAAGATTTACTCCReversed:TGGTGTTCAGATTCAGCAAGGA147NM_001244539.1ZO-1Forward:AGTTTGATAGTGGCGTTGACACReversed:GCTGAAGGACTCACAGGAACA106XM_005659811.1

1.7.3 Western blot檢測 RIPA buffer提取細胞總蛋白質，按照Braford蛋白質定量試劑盒說明書測定蛋白質樣品的濃度，使用山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室溫孵育1 h。蛋白質經SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜。以5% BSA-PBST稀釋一抗后4 ℃水平搖床孵育過夜。次日用5%BSA-PBST稀釋二抗，加入1∶10 000的山羊抗兔IgG(H+L)HRP室溫孵育1 h，加入ECL曝光顯影。

1.8 數據分析

所有指標均以孔為統計單位，采用Excel對測得的數據進行初步整理，試驗數據采用統計軟件SPSS17.0進行單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)和Duncan氏多重比較,以P<0.05為差異顯著性標準，P<0.01為差異極顯著，結果用平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 HEP對氧化應激仔豬血清抗氧化指標的影響

HEP對氧化應激仔豬血清抗氧化指標的影響結果如圖1所示。根據圖1A所知，經處理過的各組血清中的CAT含量顯著低于空白組(P<0.05)，0.6% HEP組顯著高于LPS組(P<0.05)。根據圖1B所知，處理過的各組血清中SOD的含量顯著低于空白組(P<0.05)，0.6% HEP組顯著高于LPS組(P<0.05)。根據圖1C可知，處理過的各組血清中的GSH-Px含量顯著低于空白組(P<0.05)，HEP組顯著高于LPS組(P<0.05)。根據圖1D可知，各組血清中的MDA的含量相比較，0.2%、0.4% HEP組相比空白組顯著升高(P<0.05)，LPS組和0.6% HEP組相比空白組極顯著升高(P<0.01)，各HEP組比LPS組顯著降低(P<0.05)。

與空白對照組比較，*. P<0.05，**. P<0.01；與LPS組比較，#. P<0.05，##. P<0.01；下同。A. HEP對氧化應激仔豬血清CAT的影響；B. HEP對氧化應激仔豬血清SOD的影響；C. HEP對氧化應激仔豬血清GSH-Px的影響；D. HEP對氧化應激仔豬血清MDA的影響Compared with control group, *. P<0.05, **. P<0.01; Compared with LPS group, #. P<0.05, ##. P<0.01; The same as follows. A. Effects of HEP on serum CAT in oxidative stress piglets; B. Effects of HEP on serum SOD in oxidative stress piglets; C. Effects of HEP on serum GSH-Px in oxidative stress piglets; D. Effects of HEP on serum MDA in oxidative stress piglets圖1 HEP對氧化應激仔豬血清抗氧化指標的影響Fig.1 Effects of HEP on serum antioxidant indexes in oxidative stress piglets(±s, n=3)

2.2 HEP對氧化應激仔豬血清GLN含量和DAO活性的影響

HEP對氧化應激仔豬血清GLN含量和DAO活性的影響結果如圖2所示。各組間血清中谷氨酰胺的含量由圖2A所知，LPS處理組的GLN水平顯著低于空白組(P<0.05)，經HEP處理后的各組GLN水平顯著高于LPS組(P<0.05)。圖2B反映了各組血清中DAO的含量變化情況，LPS組的DAO水平極顯著高于空白組(P<0.01)，HEP處理組的DAO水平顯著低于LPS組(P<0.05)。

A. HEP對氧化應激仔豬血清谷氨酰胺含量的影響；B. HEP對氧化應激仔豬血清二胺氧化酶活性的影響A. Effects of HEP on serum GLN in oxidative stress piglets; B Effects of HEP on serum DAO in oxidative stress piglets圖2 HEP對氧化應激仔豬血清GLN含量和DAO活性的影響Fig.2 Effects of HEP on serum GLN and DAO in oxidative stress piglets(±s, n=3)

2.3 HEP對氧化應激仔豬回腸形態結構的影響

HEP對氧化應激仔豬回腸結構的影響如圖3所示。圖3A表示HEP對氧化應激仔豬回腸絨毛的影響，其中，a圖表示絨毛的高度，空白組極顯著地高于其余各組(P<0.01)，LPS組極顯著低于其余各組(P<0.01)；b圖表示隱窩的深度，空白組極顯著低于其余各組(P<0.01)，LPS組顯著高于0.2% HEP組(P<0.05)，極顯著地高于0.4%、0.6% HEP組(P<0.01)；c圖表示絨毛高度/隱窩深度的情況，空白組極顯著高于其余各組(P<0.01)，LPS組極顯著地低于其余各組(P<0.01)。

圖3B反映了HEP對氧化應激仔豬回腸形態結構的影響，由圖b可見：回腸組織絨毛上皮細胞的單層柱狀上皮細胞局部糜爛脫落，隱窩結構受損，黏 膜層局部區域隱窩結構消失，組織疏松，表明造模成功。圖c、d、e均顯示：回腸上皮絨毛上皮細胞可見少量脫落，隱窩結構清晰，黏膜層及黏膜下層結構較正常，高劑量HEP組和空白組的結果基本相似。

A. HEP對氧化應激仔豬回腸絨毛的影響；B. HEP對氧化應激仔豬回腸形態結構的影響(圖a～e分別為空白組、LPS組、0.2%HEP組、0.4%HEP組和0.6%HEP組)，100×A. Effects of HEP on ileal villi of oxidative stress piglets; B. Effects of HEP on ileal morphology of oxidative stress piglets (Fig. a-e were control group, LPS group, 0.2% HEP group, 0.4% HEP group and 0.6% HEP group, respectively), 100×圖3 HEP對氧化應激仔豬回腸結構的影響Fig.3 Effects of HEP on ileal morphology of oxidative stress piglets(±s, n=3)

2.4 HEP對氧化應激仔豬回腸緊密連接蛋白mRNA的影響

HEP對氧化應激仔豬回腸緊密連接的影響結果如圖4。圖4A表示HEP對氧化應激仔豬緊密連接基因轉錄的影響，可知：LPS組的3種緊密連接(tight junction，TJ)基因轉錄量極顯著地低于空白組的轉錄量(P<0.01)。0.4% HEP組的ZO-1 mRNA和ClaudinmRNA轉錄量極顯著地高于LPS組(P<0.01)，0.2%、0.6% HEP組顯著高于LPS組(P<0.05)；0.2% HEP組的OccludinmRNA轉錄量顯著高于LPS組(P<0.05)，但極顯著低于其他2個HEP組和空白組(P<0.01)；0.4%、0.6% HEP組極顯著地高于LPS組(P<0.01)。

HEP對氧化應激仔豬緊密連接蛋白表達的影響結果如圖4 B和C所示。根據圖4C可以看出，三組TJ蛋白相對表達量中，LPS組均極顯著地低于空白組(P<0.01)。各HEP組的Claudin蛋白、Occludin蛋白極顯著地低于空白組(P<0.01)，0.2%、0.4% HEP組ZO-1蛋白極顯著地低于空白組(P<0.01)，0.6% HEP組顯著低于空白組(P<0.05)。各HEP組三種TJ蛋白表達量(除0.2% HEP組Claudin外)均極顯著(P<0.01)高于LPS值。

3 討 論

3.1 HEP對氧化應激仔豬血清抗氧化指標的影響

MDA、SOD、GSH-Px、CAT是動物機體抗氧化系統成分，用以清除氧自由基，從而調節氧自由基的生成和清除之間的動態平衡[12-14]。本試驗結果顯示，氧化應激狀態下的仔豬血清中的抗氧化指標有了明顯變化，SOD、GSH-Px、CAT指數下降和MDA指數升高，飼料中添加HEP后，這些指標都在向著正常的趨勢逐漸發展，這說明HEP具有一定抗氧化的能力，且濃度的不同所造成的影響也不同，中等劑量的HEP有著較好的抗氧化應激能力。

A. HEP對氧化應激仔豬緊密連接基因轉錄的影響；B. HEP對氧化應激仔豬緊密連接蛋白表達的影響；C. HEP對氧化應激仔豬緊密連接蛋白相對表達結果A. Effects of HEP on TJ gene transcription of oxidative stress piglets; B. Effects of HEP on TJ protein expression of oxidative stress piglets; C. Effects of HEP on TJ protein relative expression圖4 HEP對氧化應激仔豬緊密連接蛋白表達的影響Fig.4 Effects of HEP on expression of tight junction in ileum from oxidative stress piglets(±s, n=3)

3.2 HEP對氧化應激仔豬腸黏膜完整性的影響

小腸是動物機體內吸收轉運物質和預防疾病的重要組織器官，小腸絨毛是其發揮生理功能的基本功能單位，腸絨毛高度、隱窩深度和V/C是小腸黏膜結構完整性的重要衡量指標[15]。本試驗結果顯示，LPS應激嚴重破壞了仔豬小腸黏膜形態的完整性，使小腸黏膜功能受損，在添加了HEP之后，隨著劑量的升高，腸黏膜的形態明顯出現改善。同時，根據絨毛高度、隱窩深度和V/C值可以分析出，HEP具有保護腸黏膜的作用，增強腸黏膜對氧化應激的抵御能力，使腸道的結構和功能保持完整。

GLN是哺乳動物體內的一類條件必需氨基酸，它能有效保護腸道黏膜結構，防止黏膜萎縮，改善腸道免疫功能[16]，因此，血漿中GLN活性可直接反映腸道結構和功能的完整性。DAO是一種具有高度活性的細胞內酶，跟小腸黏膜中核酸、蛋白質的合成密切相關，可作為腸道黏膜結構與功能狀態的理想指標，其含量與腸道損傷程度呈正相關，與腸黏膜DAO活性呈負相關[17-19]。LPS的刺激，導致仔豬產生氧化應激，在破壞腸道結構的同時，引起機體GLN含量的下降和DAO含量的升高。通過在日糧中添加HEP的試驗結果顯示，不同劑量的HEP對GLN和DAO均有一定程度的影響，使受損的腸黏膜得到一些改善。

3.3 HEP對氧化應激仔豬回腸緊密連接的影響

緊密連接是保護腸黏膜屏障和腸上皮細胞間最主要的連接方式，對緊密連接起關鍵作用的是連接蛋白ZO-1、Claudin、Occludin[20-22]。本試驗結果顯示，LPS應激后，回腸中ZO-1、Claudin、Occludin蛋白表達量均顯著下降，飼料中添加HEP后，下降程度得到顯著抑制。這表明LPS的應激破壞了仔豬回腸上皮細胞的緊密連接結構，而HEP能抑制經LPS應激后腸上皮細胞緊密連接mRNA及蛋白質表達量的下降，提高緊密連接基因表達量，從而保護腸黏膜屏障功能。

4 結 論

日糧中添加猴頭菇多糖能緩解氧化應激造成的回腸黏膜損傷，維持腸上皮細胞通透性。

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