奶牛源金黃色葡萄球菌新疆流行株的耐藥特性、毒力基因及分子分型

孟 丹，孟慶玲，喬 軍*，蔡擴軍，王登峰，馬 帥，伍曄暉，才學鵬

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832003； 2.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063；3.新疆畜牧科學院獸醫研究所，烏魯木齊 830000； 4.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，蘭州 730046)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是引起奶牛乳房炎和子宮內膜炎最重要的病原菌之一，在葡萄球菌中致病力最強，含有多種酶類和毒素[1]。同時，SA也是一種人畜共患菌，特別是隨著細菌的不斷進化與演變，耐甲氧西林SA(MRSA)在人類和動物之間交叉傳播[2-3]，越來越多地受到世界衛生組織及各國學者的關注。近年來SA耐藥性菌株逐年增多，特別是MRSA流行株的大量出現，引起嚴重感染的比例也有逐年升高的趨勢，給SA感染性疾病的臨床治療帶來了極大的困難。

研究發現，SA對抗生素的耐藥性主要依賴于自身攜帶的各種耐藥相關基因，不同的耐藥基因產生耐藥的機制也不同[4]，SA常見耐藥機制包括藥物捕獲、藥物靶標的修飾、酶的失活和外排泵，均依賴于耐藥基因編碼的相關蛋白質[5]。而隨著抗生素的大量使用，作為治療MRSA“最后防線”的糖肽類抗生素萬古霉素的耐藥株不斷出現，在中國大陸，W. J. Sun等在2009年發現了一株萬古霉素中介敏感金黃色葡萄球菌(VISA)[6]，因此對新疆流行株SA的耐藥性研究意義重大。SA的致病性主要取決于其毒力相關基因，目前已報道的SA毒力相關基因有40多種[7]，毒力因子溶血素，可在宿主細胞膜上形成小孔，造成細胞內液外流而導致細胞破壞。殺白細胞毒素lukED和PVL可以對抗宿主的免疫系統。TST主要與編碼基因的一些特定可移動序列有關，可表達TSST-1，是一種超抗原，能夠直接活化T淋巴細胞，使其在感染患者體內釋放出炎癥介質而導致機體發病[8-10]。這些毒力因子(如SA編碼的表面蛋白、蛋白酶和毒素等)可協助細菌快速入侵宿主體內，并在宿主體內長時間存活，從而增強SA侵襲宿主的能力[11]。葡萄球菌染色體盒mec(SCCmec)和MLST分子分型是SA分型的兩個常用方法，由于編碼PBP2a的mecA基因位于可移動元件SCCmec上，且不同的MRSA內的SCCmec結構存在較大差異，因此可分為不同的SCCmec基因型，全球主要有8種SCCmec基因型，其中又分為若干亞型[12]。目前，在MLST數據庫中SA可以分成2 840種ST，共收錄了4 929 株菌株的相關信息，而中國食源性菌株只有91株。經eBURST V3 分析顯示，中國食源性菌株ST分布存在5個克隆群ST97、ST5、ST398、ST1和ST9，最大克隆群為ST97，主要起源克隆群為ST398[13]。因此SCCmec和MLST分子分型既可作為探討SA在人-畜-環境間傳播途徑的重要依據，也是SA流行病學調查研究的重要工具。

新疆是我國五大牧區之一，也是我國重要的奶牛養殖基地，目前奶牛存欄360余萬頭，奶牛乳房炎和子宮內膜炎已經成為奶牛養殖業最難防控的疫病之一。然而，目前對新疆地區奶牛SA流行株的耐藥特性、致病性及流行病學特性研究甚少。鑒于此，本研究通過對新疆地區SA流行株耐藥表型、相關耐藥基因、相關毒力基因的檢測及SCCmec和MLST分子分型進行研究，分析耐藥表型與耐藥基因之間、不同分子分型與毒力基因之間的相關性，為新疆地區規模化奶牛場臨床合理用藥和保障牛奶產品的安全提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Baird-Parker培養基、BHI液體培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司；大腸桿菌(E.coli) DH5α菌種由本實驗室保存；細菌基因組DNA提取試劑盒、pMD19-T載體、DNA Marker均購自TaKaRa公司；生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物紙片購自杭州微生物試劑有限公司；質粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自諾維森(北京)生物科技有限公司。

1.2 樣本采集

2014—2016年從新疆五家渠、石河子、塔城、伊犁、烏魯木齊、阿克蘇、喀什地區的15個規模化奶牛場共采集臨床型乳房炎和子宮內膜炎臨床樣品337份。采用蘭州隱性乳房炎檢測法(LMT)檢測乳樣[14]，根據臨床型子宮內膜炎的診斷標準[15]收集樣品，乳樣采集通過溫水清洗乳房并使用75%酒精棉球對乳頭進行消毒處理，收集第3把奶后的奶樣。子宮內膜炎樣品通過直腸把握子宮直接采樣法收集，放于滅菌的試劑管中，置于冰盒中，運送至實驗室進行分離培養。

1.3 SA的分離鑒定

將采集的奶牛乳樣用接種環接種于Baird-Parker培養基，子宮內膜炎樣品用棉簽涂布于Baird-Parker培養基，置于37 ℃恒溫箱培養12～48 h。挑取具有典型特征的單菌落，在營養瓊脂培養基上進行純化培養。對純化菌進行涂片、革蘭染色、鏡檢，然后隨機選取分離株用SA成套生化鑒定管測定其生化反應特性；根據GenBank中已公布的SA 16S rRNA的序列設計通用引物，對SA分離株進行16S rRNA序列比對分析，鑒定分離株為SA。將分離的SA在BHI肉湯中37 ℃培養24 h，取500 μL所得新鮮菌液加入到500 μL 40%甘油中，振蕩混合均勻制成20%甘油菌，-20 ℃保存備用。用無菌接種環挑取單個菌落接種至無菌LB培養液，于37 ℃振蕩過夜，取1.5 mL細菌培養液于無菌EP管內在12 000 r·min-1下高速離心，去掉上清液，余下操作步驟按細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明進行。DNA提取結束后，4 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后在凝膠成像系統上成像。準備好的DNA模板于-20 ℃保存，用于耐藥基因、毒力基因檢測和基因分型研究。

1.4 SA新疆流行株的藥物敏感性測定

用無菌接種環挑取單個菌落，接種于LB培養液于37 ℃培養20～24 h，再用滅菌生理鹽水將細菌濃度調至0.5麥氏濁度，取200 μL均勻涂布于MHA培養基，涂布均勻后貼上環丙沙星、苯唑西林、氯霉素、甲氧嘧啶、左氟沙星、青霉素、紅霉素、四環素、頭孢西叮、呋喃妥因、利福平、替考拉寧、克林霉素、慶大霉素、氟苯尼考、萬古霉素、利耐唑胺17種藥敏紙片，用鑷子輕壓紙片使其與培養基表面緊密接觸。放入37 ℃恒溫培養箱中培養16～24 h后測量抑菌圈直徑，依據美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)標準進行判定。

1.5 MRSA新疆流行株的篩選與鑒定

根據文獻[16]將在藥敏試驗中頭孢西叮的抑菌圈直徑小于或等于21 mm的SA篩選出來，進一步通過PCR方法擴增mecA來確定MRSA陽性菌。

1.6 SA新疆流行株耐藥基因的檢測

采用多重PCR[17]方法對大環內酯類耐藥基因(msrA、msrB)、紅霉素類耐藥基因(ermA、ermC)、乙酰基轉移酶基因(vatA、vatB、vatC)、氨基糖苷類耐藥基因(aacA-D)、四環素類耐藥基因(tetk、tetm)、林可胺類耐藥基因(linA)、氯霉素類耐藥基因(FexA、FexB)、惡唑烷酮類耐藥基因(cfr、optrA)、萬古霉素類耐藥基因(VgaA、VgaC)進行檢測。

1.7 SA新疆流行株毒力基因的檢測

所有分離株通過多重PCR[18]技術進行毒力基因白細胞毒素基因(PVL、lukED、lukM)、溶血素基因(hla、hlb、hld)、表皮剝脫素基因(eta、etb)、中毒休克綜合征毒素基因(tst)、黏附素基因(edin)和新型編碼細胞壁錨定蛋白毒力基因(sasX)的檢測。

1.8 SA流行株的SCCmecA和MLST分型

通過多重PCR方法[19]對MRSA進行SCCmec的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、Ⅴ 8個主要的型和亞型的檢測，擴增的產物送至北京華大公司測序，然后按照文獻[20]描述進行多位點序列分析(MLST)分型方法，根據每個菌株的等位基因和ST型從數據庫(http://saureus.beta.mlst.net/)獲得，來確定菌株的基因型。

1.9 引物

本研究中所用的主要耐藥基因、毒力基因、SCCmec分型及MLST分型的引物設計如表1。

2 結 果

2.1 SA新疆流行株的分離與鑒定

從新疆15個不同的牛場采集了337份樣品，其中乳樣207份，子宮內膜炎樣品130份，共分離到155株SA，乳樣分離出118株，占57.0%(118/207)，子宮內膜炎樣品分離出37株，占28.5%(37/130)，其中MSSA有133株，占85.8%(133/155)，MRSA有22株，并且22株菌的mecA基因檢測均為陽性。MRSA流行株占14.2%(22/155)。

2.2 SA新疆流行株的抗生素敏感試驗

155株SA分離株中，133(85.8%)株甲氧西林敏感型SA(MSSA)，22(14.2%)株MRSA，所有菌株均未檢出萬古霉素、利奈唑胺的耐藥表型，MSSA菌株對青霉素、紅霉素、甲氧嘧啶、四環素的耐藥率相對較高，對利福平、替考拉寧的耐藥率較低；MRSA菌株對青霉素、頭孢西叮、四環素、克林霉素的耐藥率相對較高，對環丙沙星、左氟沙星、呋喃妥因的耐藥率較低(表2)，利福平耐藥表型未檢出。相比來說，MSSA菌株對抗菌藥物的耐藥率普遍比MRSA菌株的耐藥率低，且MRSA和MSSA對抗菌藥物的耐藥菌株分布也不同(圖1)。

表1試驗中用到的引物

Table1Primersusedinthisstudy

基因種類和名稱Genetypeandname序列(5'→3')Nucleotidesequence擴增長度/bpSizeofamplifiedproduct退火溫度/℃Annealingtemperature16SrRNAF1:GTAGGTGGCAAGCGTTACCF2:CGCACATCAGCGTCAG22959耐藥基因ResistancegenesmecAF1:GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAF2:CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA31055msrAF1:GGCACAATAAGAGTGTTTAAAGGF2:AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTT94050msrBF1:TATGATATCCATAATAATTATCCAATCF2:AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTT59550ermAF1:AAGCGGTAAACCCCTCTGAF2:TTCGCAAATCCCTTCTCAAC19055ermCF1:AATCGTCAATTCCTGCATGTF2:TAATCGTGGAATACGGGTTTG29955vatAF1:TGGTCCCGGAACAACATTTATF2:TCCACCGACAATAGAATAGGG26855vatBF1:GCTGCGAATTCAGTTGTTACAF2:CTGACCAATCCCACCATTTTA13655vatCF1:AAAATCGATGGTAAAGGTTGGCF2:AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC46755aacA-DF1:TAATCCAAGAGCAATAAGGGCF2:GCCACACTATCATAACCACTA22755tetkF1:GTAGCGACAATAGGTAATAGTF2:GTAGTGACAATAAACCTCCTA36055tetmF1:AGTGGAGCGATTACAGAAF2:CATATGTCCTGGCGTGTCTA15855linAF1:GGTGGCTGGGGGGTAGATGTATTAACTGGF2:GCTTCTTTTGAAATACATGGTATTTTTCGA32357FexAF1:TTGGGAAGAATGGTTCAGGGF2:ATCGGCTCAGTAGCATCACG97750FexBF1:TTCCCACTATTGGTGAAAGGATF2:GCAATTCCCTTTTATGGACGTT75049cfrF1:TAAGAAGTAATAATGAGCPHF2:TATAGAAAGTCTACGAGG51849optrAF1:GCACCAGACCAATACGATACAAF2:TCCTTCTTAACCTTCTCCTTCTCA79457VgaAF1:ATGAAAATATTGTTAGAGGF2:AGACATGTCCTTAAAGTGATTC159449VgaCF1:CGTATGCCCAGAGTGAGF2:GAGTGCTTCCGTATCCA107355

基因種類和名稱Genetypeandname序列(5'→3')Nucleotidesequence擴增長度/bpSizeofamplifiedproduct退火溫度/℃Annealingtemperature毒力基因VirulencegenesPVLF1:ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCAF2:GCATCAASTGTATTGGACATGATCCA43355lukEDF1:TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAGF2:TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA26952lukMF1:TGGATGTTACCTATGCAACCTACF2:GTTCGTTTCCATATAATGAATCACTAC78058HlaF1:CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTGF2:CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT20958hlbF1:GTGCACTTACTGACAATAGTGCF2:GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT30956hldF1:AGAATTTTTATCTTAATTAAGGAAGGAGTGF2:TTAGTGAATTTGTTCACTGTGTCGA11154etaF1:ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGTF2:TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC19057etbF1:CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTACF2:GTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC61255tstF1:TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACTF2:TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT18057edinF1:GAAGTATCTAATACTTCTTTAGCAGCF2:TCATTTGACAATTCTACACTTCCAAC62558sasXF1:ATGAAGAGAAAACTCACAGCF2:ATTAGACCATTTAGCATCATCA34353SCCmec分型基因SCCmectypegenesSCCmecⅠF1:GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGGF2:GTTCTCTCATAGTATGACGTCC61353SCCmecⅡF1:CGTTGAAGATGATGAAGCGF2:CGAAATCAATGGTTAATGGACC39853SCCmecⅢF1:CCATATTGTGTACGATGCGF2:CCTTAGTTGTCGTAACAGATCG28053SCCmecⅣaF1:GCCTTATTCGAAGAAACCGF2:CTACTCTTCTGAAAAGCGTCG77653SCCmecⅣbF1:TCTGGAATTACTTCAGCTGCF2:AAACAATATTGCTCTCCCTC49353SCCmecⅣcF1:ACAATATTTGTATTATCGGAGAGCF2:TTGGTATGAGGTATTGCTGG20053SCCmecⅣdF1:CTCAAAATACGGACCCCAATACAF2:TGCTCCAGTAATTGCTAAAG88153SCCmecⅤF1:GAACATTGTTACTTAAATGAGCGF2:TGAAAGTTGTACCCTTGACACC32553

基因種類和名稱Genetypeandname序列(5'→3')Nucleotidesequence擴增長度/bpSizeofamplifiedproduct退火溫度/℃AnnealingtemperatureMLST分型基因MLSTtypegenesaroF1:ATCGGAAATCCTATTTCACATTCF2:GGTGTTGTATTAATAACGATATC45652glpF1:CTAGGAACTGCAATCTTAATCCF2:TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC46554gmkF1:ATCGTTTTATCGGGACCATCF2:TCATTAACTACAACGTAATCGTA42952ptaF1:GTTAAAATCGTATTACCTGAAGGF2:GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA47454tpiF1:TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAAF2:TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC40254yqiF1:CAGCATACAGGACACCTATTGGCF2:CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC51659arcF1:TTGATTCACCAGCGCGTATTGTCF2:AGGTATCTGCTTCAATCAGCG45655

表2MRSA與MSSA對抗菌藥物的耐藥率

Table2DrugresistanceratesoftheMRSAandMSSA

抗菌藥物AntimicrobialdrugsMSSA(n=133)MRSA(n=22)耐藥株數(n)Resistant(n)耐藥率/%Resistantrate耐藥株數(n)Resistant(n)耐藥率/%Resistantrate青霉素Penicillin(PEN)12291.722100苯唑西林Oxacillin(OXA)118.3940.9頭孢西叮Cefoxitin(FOX)1410.51986.4慶大霉素Gentamicin(GEN)139.81254.5利福平Rifampicin(RIF)32.300四環素Tetracycline(TCY)4433.11777.3紅霉素Erythromycin(ERY)5742.91359.1氯霉素Chloroamphenicol(CHL)3224.1731.8氟苯尼考Florfenicol(FFC)1511.3627.3萬古霉素Vancomycin(VAN)0000替考拉寧Teicoplanin(TEC)75.3522.7甲氧嘧啶Trimethoprim(TMP)5037.61463.6環丙沙星Ciprofloxacin(CIP)3425.6418.2左氟沙星Levofloxacin(LVX)2317.1418.2呋喃妥因Furadantin(NIT)2115.8418.2克林霉素Clindamycin(CLI)3123.31777.3利奈唑胺Linezolid(LNZ)0000

圖1 MSSA 和MRSA對抗菌藥物的耐藥菌株分布Fig.1 Distribution of resistant strains on antimicrobial in MSSA and MRSA

2.3 SA新疆流行株耐藥基因檢測

所有菌株均未檢測到惡唑烷酮類耐藥基因(cfr、optrA)、萬古霉素類耐藥基因(VgaA、VgaC)，其中MSSA菌株中linA(42.1%)、tetm(40.6%)和ermC(30.8%)檢出率較高，MRSA菌株中mecA(100%)、linA(90.9%)、ermC(72.7%)和VatC(72.7%)檢出率較高，多重PCR檢測到九種耐藥基因的特征性條帶(圖2)。除了四環素類耐藥基因tetk只在MSSA菌株中檢出，相比之下，MRSA的其他耐藥基因檢出率明顯高于MSSA菌株中耐藥基因的檢出率(表3)。

M. DNA相對分子質量標準DL2000；1.耐藥基因msrB、FexA； 2.耐藥基因ermC；3.耐藥基因aacA-D、tetk；5.耐藥基因mecA、tetm、VatC；6.耐藥基因linA；4、7.陰性對照M. DL2000 DNA marker;1. Resistant gene msrB, FexA; 2. Resistant gene ermC; 3. Resistant gene aacA-D, tetk; 5. Resistant gene mecA, tetm, VatC; 6. Resistant gene linA; 4,7.Negative control圖2 耐藥基因的PCR擴增Fig.2 Amplification of resistant genes by PCR

表3MRSA與MSSA對耐藥基因的分布率

Table 3 Distributing rates of antimicrobial genes in the MRSA and MSSA strains %(株)

2.4 SA新疆流行株毒力基因的檢測

SA新疆流行株檢出的主要毒力基因為白細胞毒素基因(lukED)、溶血素基因(hla、hlb、hld)和中毒休克綜合征毒素基因tst，其中溶血素基因(hla、hlb、hld)在MSSA菌株中分布率較高，毒力基因lukED和tst在MRSA中分布率較高(圖3)，可見，不同的毒力基因在SA中的分布有所差異，在MSSA菌株和MRSA菌株中的分布也有所差異(表4)。

表4MRSA與MSSA菌株毒力基因攜帶率

Table 4 Distributing rates of toxin genes in the MRSA and MSSA strains %(株)

圖3 MRSA與MSSA菌株毒力基因分布Fig.3 Distributing of toxin genes in the MRSA and MSSA strains

2.5 SA流行株SCCmecA分型

所有菌株中主要檢出的有SCCmecⅠ和SCCmecⅣa兩種分型，多重PCR檢測到兩種不同特征性條帶(圖4)，SCCmecⅡ、SCCmecⅢ和SCCmecⅤ均未檢出，在MSSA中未檢測到任何SCCmec型，MRSA中SCCmecⅠ和SCCmecⅣa的檢出率分別為77.3%(17/22)和22.7%(5/22)其中SCCmecⅠ為MRSA的主要流行株。

2.6 SA新疆流行株MLST分型

155株SA共檢測出14種ST型，MSSA菌株檢出ST188、ST584、ST9、ST805、ST2139、ST1、ST2700、ST903、ST2454、ST2990、ST63、ST X 12種ST型，ST9為主要流行株，其中有一株菌在MLST數據庫中輸入7個看家基因的等位基因后未查得所對應的ST型，假定其為ST X型，7種看家基因經凝膠電泳得到7種不同特征的條帶(圖5)。MRSA菌株檢出ST188、ST9、ST968、ST2139、ST1、ST2700、ST2373、ST63 8種不同ST型，ST1為主要流行株。此外，不同ST型菌株所攜帶的毒力基因、抗性基因、SCCmec型也存在差異(表5)，并且不同ST型攜帶耐藥基因和毒力基因的多重性也不同(圖6)。

M.DNA相對分子質量標準DL2000；1、3、7、9、10、12、15. SCCmecⅠ型；4、14、16.SCCmecⅣa型；2、5、6、8、11、13、17. 陰性對照M. DNA marker DL2000; 1, 3, 7, 9, 10, 12, 15. SCCmecⅠtype; 4, 14, 16. SCCmecⅣa type; 2, 5, 6, 8, 11, 13, 17. Negative control圖4 SCCmec分型結果Fig.4 The results of SCCmec genotyping

M. DL2000 DNA相對分子質量標準；其他條帶為7種看家基因M. DL2000 DNA marker; The other strips are 7 housekeeping genes 圖5 MLST分型電泳圖Fig.5 PCR electrophoretogram of MLST genotyping

S.甲氧西林敏感SA；R.耐甲氧西林SA；1V、2V、3V. 攜帶1、2、3種毒力基因；1R、2R、3R、4R、5R、6R. 攜帶1、2、3、4、5、6種耐藥基因S. MSSA; R. MRSA; 1V, 2V, 3V. Carrying one, two, three kinds of virulence genes; 1R, 2R, 3R, 4R, 5R, 6R. Carrying one, two, three, four, five, six kinds of resistant genes圖6 ST分型與耐藥、毒力基因多重性的分布Fig.6 Distribution of the ST types and resistant, toxin genes multiplicity

3 討 論

SA是引起人畜疾病的最重要的病原菌，也是引起人類食物中毒的四大食源性病原菌之一[21-22]。在奶牛養殖業中，SA可引起奶牛乳房炎和子宮內膜炎，成為奶牛養殖業防控最難的病原菌，嚴重阻礙奶牛業持續、快速、健康發展[23]。本研究通過對新疆不同地區規模化牛場采集的337份樣品分離鑒定發現，在分離出的155株SA中，MSSA(85.8%)是引起奶牛感染性疾病的主要流行株，MRSA(14.2%)相比MSSA，多重耐藥更加明顯。在藥敏試驗中發現，MSSA對頭孢西叮的耐藥率為10.5%，MRSA對頭孢西叮的耐藥率為86.4%，可以看出并不是對頭孢西叮耐藥的金黃色葡萄球菌一定是MRSA，依據耐藥表型來判斷MRSA在一定程度上可以作為一種標準，但不是絕對的“金標準”。可能是由于基因介導的作用較弱，也可能受環境因素(如生長溫度、培養時間等)的影響，從而干擾紙片法檢測的結果。因此需要通過檢測mecA基因進一步鑒定。MRSA產生的耐藥表型比MSSA多，但所檢出的耐藥基因與其耐藥表型不完全對應，表型敏感卻含有耐藥基因，可能與其他耐藥機制(如生物膜生成)有關，菌株表型耐藥卻未檢測到相關耐藥基因，可能是該耐藥基因未被激活，提示這些菌株雖然攜帶耐藥基因，可能這些耐藥基因并未表達，但作為“儲存庫”在一定條件下可轉化為耐藥菌株，可以通過質粒、轉座子、耐藥島使SA獲得耐藥，在細菌之間傳播，不僅具有潛在的耐藥特性，并且能夠使耐藥基因蔓延擴散，因此這類菌株在SA耐藥性傳遞和流行中可能具有重要的作用。研究表明SCCmecⅢ型菌株攜帶氨基糖苷類耐藥基因及四環素耐藥基因的質粒或轉座子，如pT181質粒和Tn554轉座子[24]，因此可見對于多重耐藥的MRSA更多可能的是通過介導的耐藥質粒隨移動遺傳元件在細菌間發生水平傳播。

毒力基因編碼的毒力因子是SA 致病的分子基礎。本研究對SA新疆流行株毒力基因檢測結果顯示，同為MRSA或MSSA的不同株會攜帶多種不同的毒力基因，如MRSA菌株可同時攜帶毒力基因hld、lukED和tst；不同毒力基因的分布也有差異，如本試驗中通過MLST分型得到的ST2373菌株只攜帶了毒力基因tst，其他的毒力基因沒有分布，提示SA的毒力差異不僅表現在菌株之間，還可能與不同菌株來源、遺傳背景以及宿主因素的影響關系密切。有研究報道，SA菌株獲得耐藥的同時伴隨毒力因子的改變，會使毒力因子表達降低[25-26]。本研究中，MSSA菌株溶血素毒力基因的檢出率稍高于MRSA，但并無顯著差異，而MRSA菌株對白細胞毒素基因和中毒休克綜合征毒素基因的檢出率高于MSSA，可能是MRSA在獲得多重耐藥的同時發生了補償性突變，抵消了溶血素毒力因子，從而降低了溶血素毒力因子的檢出率。

目前的研究發現，不同SCCmec基因型其耐藥特性及地域分布存在著明顯的差異。mecA基因位于可移動元件SCCmec上[24，27-29]。因此也驗證了對于不攜帶mecA基因的MSSA菌株未檢出SCCmec基因型的結果。研究表明，通常認為SCCmecⅠ、SCCmecⅡ、SCCmecⅢ為醫院相關性MRSA，SCCmecⅣ或SCCmecⅤ為社區相關性MRSA[30]。本研究中分離到SCCmecⅠ和SCCmecⅣa兩種型，其中SCCmecⅠ的檢出率較高，SCCmecⅠ型MRSA可能通過牛場養殖工人感染后由醫院途徑在人畜中傳播，SCCmecⅣa型MRSA可能通過環境在人畜間傳播，因此切斷病原菌在人源-動物源之間的傳播對于人MRSA的感染至關重要。

近年來，多位點測序分型(MLST)技術越來越多被用于細菌大規模的流行病學研究，一些新的ST型(如ST2816、ST772)以及在人畜共存的ST型(如ST398)被相繼報道[31-33]。在本研究中，155株SA中檢出12種ST型，其中MSSA菌株中的ST型比MRSA菌株的ST型多。ST1和ST9作為檢出率較大的兩種型分布在不同的SA中，目前已有研究報道發現，ST9可以在不同種屬的動物源、人源、食物源中分離出[34]。本研究還檢測出了一種新的假定ST X基因型，該基因型是否在人-畜間交叉傳播尚需進一步深入研究。本研究結果提示，SA在分子水平上存在著人-奶牛-環境之間傳播擴散的較大風險。相對于多重耐藥的MRSA菌株來說，在引起奶牛臨床感染的SA中大多數是MSSA，而MSSA在耐藥性、毒力及水平傳播上同樣占有重要的地位。因此，開展奶牛SA流行株耐藥特性、毒力基因及分子分型研究具有重要理論價值和實踐意義。

4 結 論

新疆地區奶牛源金黃色葡萄球菌中主要流行株為甲氧西林敏感型，但耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性更強，且毒力基因分布多樣，ST9為甲氧西林敏感型金黃色葡萄球菌流行株的主要基因型，ST1-SCCmecⅠ為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌流行株的主要基因型。

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