碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的分子特征

高倩倩， 殷 杏， 祝俊英， 秦娟秀， 黃 芊， 夏 強， 李 敏

肺炎克雷伯菌是臨床上常見的條件致病菌，可引起呼吸道、泌尿道、腸道、血液及其他無菌部位（如腹腔、胸腔、關節等）的多部位感染[1]。碳青霉烯類抗生素是目前臨床上治療產超廣譜β內酰胺酶（ESBL）腸桿菌科細菌感染的首選藥物，然而隨著臨床的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的比例逐年上升[2]，產碳青霉烯酶是其耐藥及廣泛傳播的主要原因之一，并有研究報道已出現高毒力高耐藥菌株[3-4]。如果這類菌株廣泛出現并傳播，會造成嚴重的難治性感染。本課題旨在研究CRKP常見碳青霉烯類耐藥基因與毒力基因的分布及分子流行病學特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2015年上海仁濟醫院和長征醫院臨床分離84株非重復CRKP，其中54株來自上海仁濟醫院，30株來自長征醫院。

1.2 儀器和試劑

藥敏紙片（英國OXOID公司），血瓊脂培養基、MH瓊脂培養基（法國生物梅里埃公司），聚合酶鏈反應（PCR）擴增以及純化試劑盒（日本TaKaRa公司），PCR擴增儀（Eppendorf公司），VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定藥敏試驗分析儀（法國生物梅里埃公司），基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MF， Microflex LT/Sh，BRUKER，德國）。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗

全部菌株使用VITEK 2 -Compact全自動微生物鑒定儀鑒定為肺炎克雷伯菌，并經MALDI-TOFMF儀驗證。藥物的敏感性通過紙片擴散法檢測，檢測藥物有：阿米卡星、頭孢他啶、慶大霉素、氨芐西林、環丙沙星、哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢唑林、厄他培南、美羅培南、亞胺培南15種抗菌藥物。大腸埃希菌ATCC 25922為藥敏試驗質控菌株。

1.4 多位點序列分型（MLST）

個管家基因：rpoB、gapA、mdh、pgi、infB、tonB、infB并測序，引物參見網站：（http：//bigsdb.web.pasyeur.fr/klebsiella/Klebsiella.html），測序結果提交MLST網站（http：//www.pasteur.fr/recherche/Genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html）進行序列比對。

1.5 高黏液表型（HM）檢測

應用黏液絲試驗檢測，用接種環輕觸血瓊脂平皿上培養過夜的新鮮菌落向外牽拉，重復牽拉2次，若2次均有黏液絲形成并且長度大于5 mm即判為HM表型陽性，即該菌株為HM菌株[5]。

1.6 耐藥基因及毒力基因檢測

煮沸法制備模板，PCR擴增耐藥基因blaKPC-2、blaNDM、blaVIM、blaOXA、blaIMP及毒力基因rmpA、mrkD、entB、ybtS、magA、iutA、allS、kfu并由上海鉑尚生物有限公司完成雙向測序，測序結果在NCBI上比對（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），引物序列及擴增條件參考文獻[3, 6]。

1.7eBUEST軟件分析親緣關系

據使用eBURST軟件（Version3，http：//eburst.mlst.net/）進行親緣關系分析。7個位點中6個相同定義為一組，即為克隆群，構建進化關系圖譜。1個分型組中包含4個或4個以上ST型的定義為1個克隆復合體CC。每個克隆復合體中有1個經計算推測認為是起源的ST型，即為群主，該克隆復合體中的其他ST型是在起源的ST型基礎上進化而來的。與起源的ST型相比，有1個管家基因編碼不同的ST型稱為單個位點變異型（SLV），有2個管家基因編碼不同的ST型稱為雙位點變異型（DLV），不屬于任何一個克隆復合體的ST型稱為單個型。

1.8 統計方法

應用WHONET5.6軟件對藥敏試驗結果進行統計分析，折點解讀參考美國CLSI 2016標準，Fisher確切概率法，比較不同克隆型毒力基因及耐藥基因的攜帶率；判斷不同克隆型耐藥差異，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株分布

收集2015年CRKP共84株。多來源于呼吸道標本（58.3%，49/84，包括痰、肺泡灌洗液），其次是無菌體液（17.9%，15/84），血（13.1%，11/84）和皮膚軟組織（6.0%，5/84）及尿（4.8%，4/84）。菌株最多檢出于ICU（31.0%，26/84），其次為外科（29.8%，25/84），干部病房（17.9%，15/84），內科（13.1%，11/84），門急診和骨科分別檢出5株和2株。

2.2MLST分析結果

84株CRKP分為8個不同ST型，其中主要的流行菌株是ST11（84.5%，71株），其余為ST15（4株）、ST323（4株）、ST1869（1株）、 ST722（1株）、 ST1647（1株）、 ST709（1株）、ST45（1株）。侵襲性感染（無菌體液和血液）的26株菌中ST11有25株（占96.2%），非侵襲性感染菌株中ST11型占79.3%（46/58），差異有統計學意義（P＜0.05）。4株ST323有1株為侵襲性感染，而4株ST15均為非侵襲性感染。

2.3 藥敏試驗結果

84株CRKP對亞胺培南、美羅培南及厄他培南耐藥率均為100%，對環丙沙星和阿米卡星耐藥率分別為77.4%和82.1%，對頭孢菌素類、氨基糖苷類、青霉素類耐藥率均超過90%。不同ST型耐藥率見表1。

表1 84株CRKP對15種抗菌藥物的耐藥情況Table 1 Resistant rates of 84 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents[n ( % ) ]

2.4 碳青霉烯酶耐藥基因分布

PCR及測序結果顯示84株CRKP中78株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因，其中不同ST型耐藥基因分布見表2。

表2 不同ST型CRKP耐藥基因分布情況Table 2 Prevalence of antimicrobial resistance gene in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains in terms of ST types[n ( % ) ]

2.5HM表型檢測及毒力基因分布

84株CRKP中，黏液絲試驗顯示2株HM 表型， MLST分型均為ST11，且攜帶有mrkD、entB、ybtS、rmpA和ituA毒力基因。不同ST型攜帶毒力基因見表3。

2.6eBURST軟件分析種群結構

將本研究的數據結合PubMLST數據庫中已有的肺炎克雷伯菌序列型進行eBURST分析。84株CRKP分為8個ST型，2個ST群。每個ST群分別包括2個ST型（ST11和ST1869，ST15和ST709）。其他4個ST型都是單個ST型。84株ST型菌株再與MLST數據庫中相關的500株肺炎克雷伯菌比較，后者分為37個克隆群，其中有16個克隆群有其相應的群主（CC258、CC292、CC65、CC17、CC163、CC15、CC37、CC29、CC133、CC273、CC131、CC347、CC42、CC91、CC34、CC76），本實驗71株ST11、4株ST15、4株ST323和1株ST45分別屬于CC258、CC15、CC163克隆復合體。見圖1。

表3 不同ST型CRKP毒力基因分布情況Table 3 Prevalence of virulence genes in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains in terms of ST types[n ( % ) ]

圖1 MLST數據庫種群快照圖Figure 1 Population snapshot in multi locus sequence typing database

3 討 論

肺炎克雷伯菌是臨床上常見的條件致病菌，CRKP的出現與播散是世界性的共同難題[1-2，7]。近年不斷有報道發現了高耐藥高毒力的肺炎克雷伯菌[3-4，8]，該種菌株的出現給患者的生命造成了極大威脅。本研究針對耐藥基因與毒力基因的攜帶情況及分子流行病學特征展開深入研究，以明確表型和基因特征。

本研究發現CRKP除對環丙沙星及阿米卡星的耐藥率為77.4%和82.1%外，對其他臨床常用多種藥物高度耐藥，包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類及氨基糖苷類等，耐藥率均在90%以上，使CRKP感染患者面臨無藥可治的風險。產碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的機制之一，目前最受關注的是Ambler A組的KPC-2型碳青霉烯酶，因其通常由質粒介導，且能在不同病原菌尤其是腸桿菌科細菌中表達，故其流行范圍最廣[9-10]。本研究耐藥基因檢測結果顯示，90.5%攜帶blaKPC-2基因，1.2%分別攜帶blaNDM、blaIMP，僅1株CRKP同時攜帶blaKPC-2和blaNDM，這與其他報道相比較低[11-12]。另外本實驗中有6株未檢測出碳青霉烯酶基因，其耐藥機制可能與膜通透性改變或外排泵有關，同時這也提示肺炎克雷伯菌的耐藥表型受多種耐藥機制的影響[6]。根據不同克隆型耐藥基因的分布可知，其中98.6%的ST11攜帶有blaKPC-2，提示產KPC酶是這2所醫院CRKP的主要耐藥機制。

84株CRKP的毒力基因檢測發現mrkD、entB、ybtS攜帶率較高，達90%以上，其他毒力基因攜帶率較低。其中mrkD編碼黏附性菌毛的黏附作用是致病的先決條件，本研究中僅檢出2株mrkD陰性CRKP。entB、ybtS同屬于鐵載體系統，其具有雙重作用，一方面能抑制T細胞增值，另一方面可以攝取鐵，均被認為與肺炎克雷伯菌的毒力相關。此外，本研究還檢出2株HM型菌株，其毒力基因檢出率要明顯高于其他非黏液型菌株，建議實驗室除了開展對肺炎克雷伯菌的耐藥性檢測外，還應該留意檢測肺炎克雷伯菌的黏液表型，并及時與臨床溝通。

84株CRKP進行MLST分型，eBURST分析分為8個ST型，親緣關系較近的有ST11和ST1869，ST15和ST709，其中84.5%的菌株為ST11，是本次研究的主要ST型，與本地區之前的報道相比，主要ST型并沒有發生改變[13]。本研究也發現ST15和ST323在小范圍內有一定的傳播，提示耐藥菌株具有多樣性的特點。分子流行病學分析發現，產KPC酶的肺炎克雷伯菌主要是ST11和ST15，兩者blaKPC-2陽性率之和達97.2%，主要分布在ICU及神經外科等感染多發科室。

綜上所述，上海2所醫院主要流行的CRKP克隆株是ST11，CRKP對大多數臨床常用抗菌藥物高度耐藥，其主要的耐藥機制是產KPC酶，并呈現出克隆傳播趨勢。在84株CRKP中出現2株高毒力克隆株，醫院相關部門應對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌開展更廣范圍的監測，積極控制CRKP的流行傳播，尤其控制高毒力高耐藥菌株的傳播，同時醫護人員應遵循規范化操作，盡量避免由醫護人員導致的傳播，臨床醫師在抗感染治療時，應綜合各方面考慮，合理和聯合用藥，盡量減輕抗生素對細菌的選擇壓力。

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