呼吸機相關性肺炎患者血與痰標本中分離的鮑曼不動桿菌分子流行病學分析

王露霞，鄭英俊， 郭振輝，李 理， 王曉雅， 李建勛， 卓 超

鮑曼不動桿菌是臨床重要條件致病菌，具有容易獲得耐藥性及傳播的特點。感染類型包括醫院獲得性肺炎（HAP）、尿路感染、中樞神經系統感染、創口感染、菌血癥等，尤以呼吸機相關性肺炎（VAP）最常見。一項亞太地區有關HAP/VAP流行病學調查（ANSORP）表明鮑曼不動桿菌的分離率在HAP/VAP居于前3位，約20%～40%，其中中國HAP/VAP的分離率都居第1位，分別為16.2%和35.7%，且幾乎全為多重耐藥株，對碳青霉烯類耐藥率超過50%[1]。鮑曼不動桿菌HAP/VAP合并血流感染帶給臨床更大的挑戰，其病死率高于單純HAP患者，并且鮑曼不動桿菌性肺炎繼發血流感染的病死率（35.6%）也高于其他原因所致的鮑曼不動桿菌血流感染病死率（7.3%）[2]。鮑曼不動桿菌HAP進展為HAP合并血流感染的機制并不清楚，雖然有報道提示，初始不恰當的抗生素治療、嚴重的基礎疾病等臨床危險因素可導致鮑曼不動桿菌HAP進展為菌血癥[3-4]，但有關病原學本身在其中所起作用卻鮮有報道。為此，本研究通過對照研究，從鮑曼不動桿菌的分子流行病學特征入手，研究病原學在鮑曼不動桿菌肺炎進展到合并血流感染中所起作用，為臨床早期防控鮑曼不動桿菌感染提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

所有菌株來自2015年6－12月入住我院ICU、內科（M）ICU VAP患者痰培養、血培養分離出的鮑曼不動桿菌，剔除來自同一患者同一標本的重復菌株。3株參考菌株：不動桿菌基因種型13TU（Acinetobacter nosocomialis）、不動桿菌基因種型3（Acinetobacter pittii）和鮑曼不動桿菌由浙江大學邵逸夫醫院俞云松教授惠贈。

1.2 研究方法

1.2.1 病例分組和診斷標準 入選患者符合美國ATS/IDSA 2005年HAP/VAP診斷標準[5]。若患者符合相隔48 h內出現血培養及痰培養鮑曼不動桿菌陽性兩個條件，且血培養陽性為雙瓶以上，歸為VAP合并血流感染組，稱A組；若患者血培養為陰性，僅痰培養出鮑曼不動桿菌為B組（鮑曼不動桿菌呼吸感染/定植）。若患者血培養有鮑曼不動桿菌以外的細菌則不納入本研究分析。

1.2.2 臨床資料收集 查閱患者臨床資料、實驗室數據。統計兩組患者基本信息，入住ICU、MICU時間，是否接受侵襲性操作以及采取痰或血標本日期±1 d的各項臨床征象等指標。

1.2.3 菌株鑒定和藥敏試驗 菌株鑒定及藥敏采用全自動微生物系統VITEK 2-Compact儀器（法國生物梅里埃公司）。有關鮑曼不動桿菌復合體中3個基因型（13TU、不動桿菌基因種型3和鮑曼不動桿菌）的鑒定則參照文獻[6]方法以16S-23S rRNA予以分類 。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳（PFGE） 參照文獻 [7]：制備膠塊、裂解細胞、洗膠、膠塊DNA酶切、加樣、電泳等；①條帶完全相同判斷為克隆株；②條帶差異1～3條判斷為克隆亞型；③條帶差異4～6條判斷為可能克隆亞型；④條帶差異大于7條以上判斷為非克隆株。用生物學軟件 BioNumerics結合肉眼比對將PFGE 結果進行非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析。

1.2.5 多位點序列分型（MLST） 分析提取細菌DNA模板，參照文獻報道制定的MLST引物設計方案[8]，PCR擴增gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi、rpoD共7個管家基因，引物見表1。PCR擴增產物進行測序，產物序列與鮑曼不動桿菌MLST數據庫（http：//pubmlst.org/abaumannii/info/primers.sht）進行比對。若MLST數據庫中查找不到測序結果所得到的ST型，經核實后，確認為新的ST型，新的管家基因序列和ST型及菌株相關資料上傳到數據庫。

1.2.6 數據統計分析 采用WHONET 5.6進行藥敏數據分析，采用SPSS17.0進行原始數據分析，計量資料比較采用t檢驗，不同分類構成比的計數資料比較采用卡方檢驗。危險因素分析采用COX回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 管家基因引物序列及產物長度Table 1 Primer sequences for housekeeping genes and the corresponding product size

2 結果

2.1 菌株分型及相關臨床信息

入選A組患者14例，獲得鮑曼不動桿菌非重復菌株28株（同一患者血和痰標本各計1株）；入選B組28例患者僅痰培養出鮑曼不動桿菌，獲得非重復菌株28株。由于在臨床實際工作中無法通過常規的方法鑒別鮑曼不動桿菌的種屬，故統一報告為鮑曼不動桿菌復合體，借助16S-23S rRNA基因間區特征進行準確鑒定。A組28株菌中，有26株菌16S-23S rRNA基因間區序列比對結果與鮑曼不動桿菌相似度大于99%，鑒定確認為鮑曼不動桿菌；2株菌與Acinetobector pittii相似度大于99%，確認為Acinetobector pittii。B組28株菌中，有26株菌鑒定確認為鮑曼不動桿菌，1株菌為Acinetobector pittii， 1株菌為Acinetobector nosocomialis。臨床信息顯示，A組入住ICU的天數為（18.93±17.00）d，14-day死亡14例（50.0%）；B組的入住ICU天數為（21.61±13.80） d，14-day死亡4例（14.3%）。其余臨床征象指標差異無統計學意義。見表2。

2.2 藥敏試驗結果分析

兩組鮑曼不動桿菌體外對10種抗菌藥物的耐藥率均達到50.0%～100%，僅替加環素對鮑曼不動桿菌有較好的抗菌活性。兩組間藥物敏感性差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 菌株PFGE 分析

A組14例患者的各自血與痰標本分離株均為同一克隆；28株菌株分為6個克隆型， A、B、C、D、E、F型克隆株分別為8株、6株、4株、4株、4株、2株； B組28株分為9個克隆型，其中包括A組中A-E 5個克隆型，共21株，其余7株為G型（3株）、H型（2株）、J型（1株）和K型（1株）。

2.4MLST分型

56株鮑曼不動桿菌通過MLST分為13個ST型，其中ST 195、ST 208、ST 457、ST N2構成比分別為28.57%、19.05%、11.90%、14.29%，為主要流行株。有5個新的ST型（分別以N1、N2、N3、N4和N5表示），其已知ST型僅有1個或2個管家基因的差別，親緣關系較近，多見于管家基因gpi和gyrB的差異。A組與B組的ST 195、ST 208、ST 457、ST N2主要流行株的分布差異無統計學意義（P ＞ ?0.05）。見表4。

表2 A組與B組各項臨床指標對照比較Table 2 Clinical data compared between patients with A. baumannii isolates from blood and sputum and those with A. baumannii isolates only from sputum

表3 兩組分離鮑曼不動桿菌對常見抗菌藥物的耐藥率比較Table 3 Antimicrobial resistance rates of Acinetobacter baumannii isolates compared in terms of specimen source

2.5MLST分型同源性分析

結合分型結果和PubMLST數據庫，使用eBURST軟件進行菌株基因同源性分析，56株鮑曼不動桿菌共發現13個ST型，其中7個ST型（ST 195、ST 208、ST 457、ST 369、ST N1、ST N2、ST N5）屬于克隆復合體92（clonal complex 92，CC92），CC92不同ST型關系進化見圖1，CC92占所有菌株的83.3%。屬于同一個克隆復合體的各個ST型之間僅有1個或2個管家基因的差別，親緣關系較近，多見于管家基因gpi和gyrB的差異。CC92菌株比例在A組和B組中的分布，并未發現差異（P＞0.05），見表4和圖1。

3 討論

鮑曼不動桿菌是我國近年醫院感染中最常見的、最難治療的細菌之一。一方面，鮑曼不動桿菌幾乎都為多重耐藥，且對碳青霉烯類耐藥率也超過50%，使臨床可選用的抗菌藥物很有限；另一方面，該菌最常見于患者下呼吸道，臨床很難判斷其是感染菌還是定植菌，常導致過度治療或治療不足的矛盾。然而，近年流行病學調查發現，鮑曼不動桿菌血流感染的比例呈上升趨勢，大多繼發于HAP或VAP，而且與單純的肺炎相比，患者往往感染嚴重，病情進展快，病死率較高[1]。據文獻報道，患者入住ICU時間、機械通氣、行連續腎臟替代療法、置中心靜脈導管為鮑曼不動桿菌血流感染的危險因素[9]。同時，來源于血流感染的鮑曼不動桿菌也常表現為多重耐藥甚至廣泛耐藥，使臨床治療更是面臨困境。一項有關腫瘤患者合并廣泛耐藥鮑曼不動桿菌菌血癥的臨床研究顯示，63%患者在確診血流感染后給予了恰當的抗菌藥物（包括多黏菌素），但30 d病死率仍然達到83.7%，且死亡原因主要與感染嚴重有關[10]。本研究也發現，來源于VAP合并血流感染組患者的14 d病死率達50%，而未合并血流感染組患者的14 d病死率僅為14%。雖然比較兩組多項與血流感染有關的危險因素，未發現有統計學差異，但這不排除本研究樣本量較小所致的統計偏倚。

表4 A組與B組各ST型分布比較Table 4 Distribution of ST types compared between Acinetobacter baumannii strains in terms of specimen source

圖1 56株鮑曼不動桿菌基因同源性分析結果Figure 1 Analysis of the genetic homology for 56 strains of Acinetobacter baumannii

有關鮑曼不動桿菌血流感染的危險因素多集中于宿主因素分析，而關于病原學分子特征的分析報道較少。Chuang 等[11]分析了鮑曼不動桿菌復合體中3個種類致菌血癥患者的臨床特征，發現多重耐藥株多出現于鮑曼不動桿菌，而且患者的病死率也高于種型13TU和種型3。本研究也得到類似結論，A組和B組菌株幾乎都屬于鮑曼不動桿菌，而且多為多重耐藥株。為此，進一步對兩組鮑曼不動桿菌進行ST型分析，發現ST 195、ST 208、ST 457、ST N2型占到了總菌株數的73.8%，為主要流行株。而既往報道，ST195及ST457也正是廣東省鮑曼不動桿菌最常見的ST型序列[12]，由此也提示，主流克隆株的長期存在是導致臨床鮑曼不動桿菌感染/定植高發的重要原因。同時，發現兩組中ST型分布無差異，均以ST 195、ST 457、ST N2為主要ST型，eBURST分析顯示這幾種ST型屬于CC92， CC92不僅在國內表現為主要的流行克隆復合體，同時也呈現全球范圍流行趨勢[13-14]。CC92群中兩個管家基因gpi和gyrB容易突變，衍生更多的新亞型，如本研究發現的STN1、STN2和STN5。因此，加強對鮑曼不動桿菌CC92克隆的主動監控，防止其在病區內傳播，對于降低鮑曼不動桿菌感染和病死率尤為重要。

總之，通過對照研究，分析鮑曼不動桿菌在肺炎合并血流感染中，細菌分子流行病學特征，結果表明，本研究并未發現國外報道的高毒力鮑曼不動桿菌ST10型菌株[15]，本院鮑曼不動桿菌肺炎合并血流感染仍以CC92流行克隆為主。而宿主方面的病情程度是合并血流感染的主要危險因素。

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