臨床分離萬古霉素耐藥腸球菌van基因型及分子分型

周 迎， 楊 洋， 郭 燕， 鄭永貴， 吳 湜， 徐曉剛

萬古霉素耐藥腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）已經逐漸成為醫院感染的重要病原菌，可引起尿路、腹腔、傷口感染，以及血流感染、心內膜炎等嚴重感染性疾病。中國大陸地區VRE主要攜帶vanA和vanM 兩型耐藥基因簇[1-2]，vanA與vanM耐藥基因簇均屬于D-丙氨酸：D-乳酸連接酶（D-Ala：D-Lac ligase）基因簇，常介導宿主菌對萬古霉素等糖肽類抗菌藥物耐藥。本研究對2016年分離自上海地區6所醫院的17株VRE進行耐藥基因及多位點序列分型（MLST）分析，為此類耐藥菌感染防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 17株VRE均于2016年分離自上海地區。vanM基因型VRE陽性對照株Efm-HS0661以及質控菌株糞腸球菌ATCC29212均為本研究所保存菌種。vanA基因型VRE參考菌株由香港中文大學凌建華博士惠贈。

1.1.2 主要試劑及儀器 Mueller-Hinton 瓊脂、Columbia 瓊脂、BHI瓊脂及肉湯（OXOID，英國）；陽離子調節MH肉湯（Cation-Adjusted Mueller Hinton II Broth， CAMHB）（BD，美國）。氨芐西林、左氧氟沙星、萬古霉素、紅霉素、克林霉素、利奈唑胺、甲氧芐啶-磺胺甲唑、替考拉寧、呋喃妥因和利福平等藥敏卡購自溫州康泰公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；限制性內切酶TaKaRa Ex Taq、TaKaRa Taq? HS PCR Kit（UNG plus）及PCR儀購自大連寶生物公司；質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、電泳系統及凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 菌種確認 根據參考文獻合成通用引物8F、1492R[3]，擴增17株臨床分離VRE的16S rRNA基因，測序后與GenBank序列進行比對，以進一步確認菌種。

1.2.2 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法測定VRE對氨芐西林、左氧氟沙星、萬古霉素、紅霉素、克林霉素、利奈唑胺、甲氧芐啶-磺胺甲唑、替考拉寧、呋喃妥因和利福平的MIC值。采用瓊脂稀釋法測定磷霉素對VRE的MIC值。根據CLSI 2017版標準[4]對結果進行判讀。

1.2.3 DNA模板制備和MLST分型 將凍存菌株轉種哥倫比亞血平皿，37?℃過夜培養后挑取菌落至已注入500 μL TE（pH8.0）的1.5 mL Eppendorf離心管，調節菌液濁度至2麥氏單位，100?℃ 加熱10 min后5 000 g離心5 min取上清液備用。

擴增屎腸球菌基因組上的7個管家基因：AtpA、Ddl、Gdh、Purk、Gyd、PstS和Adk，將PCR產物純化后測序。參照屎腸球菌MLST分型數據庫（http：//efaecium.mlst.net/）提供的步驟進行MLST分型。

1.2.4 van基因分型 參照參考文獻進行多重PCR擴增[5]，擴增所需引物見表1。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠，電壓6 V/cm電泳30 min后染色讀取結果。

表1 本研究所采用的PCR引物Table 1 Primers used in this study

2 結果

2.1VRE臨床株菌種鑒定及藥敏測定

17株VRE臨床株經16S rRNA基因測序確認均為屎腸球菌。常用抗菌藥物對17株臨床分離VRE的MIC結果見表2。本研究所測VRE對萬古霉素及替考拉寧耐藥率高，分別為100%（17/17）和70.6%（12/17）；但對于磷霉素和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率低，分別為29.4%和5.8%；所有分離株對利奈唑胺均敏感。

2.2 VRE臨床分離株van基因分型

17株VRE中，13株檢出vanA基因，9株檢出vanM基因，其中5株同時檢出vanA和vanM基因，見圖1。

2.3VRE臨床分離株MLST分型

通過MLST分型，17株VRE中ST78型8株（47.1%）、ST80型4株（23.5%）、ST555型2株（11.8%），其余3株分別為ST117型、ST262型和ST341型。分型結果顯示，2016年上海地區分離VRE以ST78型為主。

3 討論

VRE自1988年首次報道以來[6]，已在全球播散，成為最重要的醫院感染病原菌之一。VRE對醫院內環境適應性強[7]，且治療藥物有限。VRE的耐藥性可通過攜帶耐藥基因的移動元件在腸球菌屬細菌中傳播，甚至跨種屬傳播，例如傳遞至致病性更強的金黃色葡萄球菌，產生萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌。根據2009年至2012年美國國家醫療安全監測網絡（NHSN）數據顯示[8]，腫瘤患者血流感染的主要病原菌中，腸球菌（11.4%）僅次于凝固酶陰性葡萄球菌和大腸埃希菌位列第3，其中耐萬古霉素屎腸球菌占82.5%。VRE在中國地區耐藥率一直較低，但是近年來有逐年增多的趨勢。根據2005－2014年CHINET耐藥性監測數據顯示，屎腸球菌對萬古霉素的耐藥率由0.6%上升至4.2%[9]。

表2 17株萬古霉素耐藥腸球菌基因型及其對抗菌藥物的敏感性Table 2 Genotypes and antimicrobial susceptibility of 17 vancomycin-resistant Enterococcus strains

圖1 van基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of van gene PCR products

根據VRE耐藥表型和van基因簇結構的特點，已有9型腸球菌van基因型被命名，分別是vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM和vanN[10-11]。它們對萬古霉素和替考拉寧的耐藥水平各不相同，但是耐藥機制相似：通過合成與萬古霉素親和力下降的新細胞壁前體而形成耐藥。vanA、vanB、vanD和vanM型介導VRE菌株產生含D-丙氨酸-D-乳酸（D-Ala-D-Lac）末端的細胞壁前體，導致細菌對萬古霉素高度耐藥（MIC≥64 mg/ L）。國外流行病學數據顯示，vanA及vanB型最為常見[12]，但我國分離VRE的基因型有所不同，主要為vanA型，vanB型少見。上海地區vanM較為常見[1-2]。

我們前期已建立一種基于多重PCR技術的VRE萬古霉素高水平耐藥基因快速分型方法[5]，對2016年上海地區臨床分離的17株VRE進行van基因及分子分型。分型結果顯示臨床分離株中van基因型僅有vanA和vanM型兩型，首次發現同時攜帶vanA及vanM 的VRE菌株。對VRE菌株進行進一步藥敏分析，結果顯示，17株VRE菌株均對萬古霉素耐藥，但對替考拉寧耐藥率僅為70.6%（12/17）。本研究已對這些VRE菌株的van基因簇進行了初步分析，在van基因簇中發現了一些插入及缺失變異（待發表結果），但這些變異是否會導致細菌對替考拉寧敏感性變化還有待證實。由于攜帶單一van基因VRE與攜帶vanA及vanM兩型van基因的VRE菌株相比，其耐藥表型無明顯差異，目前van基因檢測方法常不包括vanM基因，故當前國內外van基因分子流行病學研究可能漏檢vanM基因，低估vanM型VRE的危害。

總之，2016年上海地區臨床分離的VRE基因型仍僅有vanA和vanM 兩型，MLST分型顯示17株VRE分屬6種ST型，提示vanA和vanM 兩種耐藥基因可在不同屬腸球菌株之間進行水平傳播。首次發現了同時攜帶vanA和vanM 2種高水平耐藥基因的VRE，攜帶2種耐藥基因的VRE檢出率高達29.4%（5/17），值得關注。

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