肝組織及血清中的Ang Ⅱ、TGF—β1在慢乙肝肝纖維化中的作用研究

方佩佩+潘陳為+諸葛璐+林秀珍+金玲湘

[摘要] 目的 探討肝組織及血清中AngⅡ、TGF-β1的表達與不同程度慢乙肝患者肝纖維化的關系。 方法 選取2015年1月～2016年12月在本院住院的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）1～2倍升高的慢性HBV感染患者50例，均行肝穿刺活檢術。根據Metavir評分系統進行組織學活動度（histologic activity，A）和纖維化分期（fibrosis，F）評分，將其分為輕度纖維化組（

[關鍵詞] AngⅡ；TGF-β1；肝星狀細胞；肝纖維化

[中圖分類號] R512.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）35-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of AngII and TGF-β1 in liver tissue and serum and its relationship with chronic hepatitis B hepatic fibrosis with different degrees. Methods 50 patients with chronic HBV hospitalized in our hospital whose ALT was increased by 1-2 times from January 2016 to December 2016 were selected. Liver biopsy was performed in all patients. According to the Metavir scoring system， scores of histologic activity（A） and fibrosis staging （F） were calculated， and the patients were divided into mild fibrosis group（

[Key words] AngII； TGF-β1； Hepatic stellate cell； Liver fibrosis

眾所周知，我國是個乙肝大國，1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%，與肝纖維化相關的肝硬化及肝細胞癌現已成為嚴重的社會和公共衛生問題[1]。肝纖維化是肝臟中細胞外基質（extracellular matrix，ECM）增生與降解失衡，導致肝臟內纖維結締組織異常沉積的結果[2]，其中肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化的細胞學基礎[3]。轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）使HSC激活，而HSC激活后又可分泌TGF-β1，形成TGF-β1與HSC激活之間的惡性循環[4]。近年研究發現，肝臟中存在完整的RAAS生化鏈，且與肝纖維化密切相關。當肝臟受到各種損傷因子作用時，血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅱ可通過增加HSC TGF-β1的表達促進HSC活化[5]。因此，從TGF-β1及AngⅡ信號通路研究乙肝引起的肝纖維化將是一個全新可行的方向。本研究對比分析不同程度纖維化的慢乙肝患者血清及肝臟AngⅡ、TGF-β1的水平，進一步探討AngⅡ、TGF-β1與肝纖維化的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月～2016年12月本院住院的慢性HBV感染患者50例。入選標準：（1）HBsAg陽性≥6個月；（2）HBV DNA≥105 IU/mL；（3）丙氨酸氨基轉移酶（ALT）1～2倍升高（我院ALT正常范圍9～50 U/L）。排除標準：（1）合并其他病原體感染或藥物、酒精、免疫、中毒、遺傳代謝等其他因素所致的ALT升高；（2）合并有高血壓、糖尿病、腎功能不全或近期使用ACEI、ARB類藥物等可能干擾RAS系統的患者。所有的患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 肝穿刺活檢術 50例患者均行超聲定位下肝穿刺活檢術，肝活檢組織檢查采用單人操作法，選擇16G活組織檢查穿刺針，經B超實時定位下，經皮快速穿刺獲取肝組織。獲取的肝組織必須在2 cm以上（至少包括3個以上匯管區）。肝臟組織病理HE染色：觀察患者肝臟炎癥活動度和纖維化程度。根據Metavir評分系統中的組織學活動度（histologic activity，A）和纖維化分期（fibrosis，F）標準（詳見2015年《慢性乙型肝炎防治指南》）[1]，將患者分為兩組，其中輕度肝纖維化組28例（mild fibrosis，MF組，Metavir評分

1.2.2 血清學檢測方法 血清TGF-β1，Ang Ⅱ采用ELISA法，HBV血清標志HBsAg、AntiHBs、HBeAg、AntiHBe、AntiHBc檢測采用ELISA法，HBV DNA采用熒光定量PCR法，血清ALT、AST、肝纖維化4項指標、AFP等測定采用自動生化分析儀。

1.2.3 免疫組化法 觀察TGF-β1、Ang Ⅱ在患者肝組織中的分布及其關系：所有肝組織樣本均予10%甲醛固定，石蠟包埋，蠟塊連續切片3張，分別予TGF-β1及Ang Ⅱ免疫組化法染色。切片每張厚度約4 μm，免疫組化染色采用SP法，嚴格按照說明書操作。用已知陽性組織切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（PBS）替代一抗作為陰性對照。TGF-β1、Ang Ⅱ評分通過染色強度及陽性細胞百分比進行綜合評分：每張切片在高倍鏡下隨機選取10個視野，采用半定量評分法。根據細胞的染色面積及染色強度進行綜合評分。染色面積評分：無細胞染色為0分，<25%細胞染色為1分，25%～50%細胞染色為2分，>50%細胞染色為3分；染色強度：0分，無色；1分，染色弱但明顯強于陰性對照；2分，染色清晰，中等程度；3分，染色程度強。按照兩者積分相加進行評定：0～1分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++），（++～+++）定為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS14.0版統計學軟件進行數據處理。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料與生化學檢查結果比較

50例入選患者，根據肝活檢結果分為：（1）MF組共28例，其中男18例，女10例，年齡21～38歲，平均（29.25±6.25）歲。（2）AF組共22例，其中男15例，女7例，年齡24～36歲，平均（32.5±7.5）歲。兩組間年齡、性別差異無統計學意義（P>0.05）。肝功能、HBV DNA等結果見表1。

2.2 兩組血清肝纖維化指標結果比較

血清肝纖維化：透明質酸、層粘連蛋白、三型前膠原這三個指標，AF組均顯示高于MF組（P<0.05）。而四型膠原MF組與AF組間差異無統計學意義。見表2。

2.3 兩組血清Ang Ⅱ及TGF-β1水平比較

MF組與AF組Ang Ⅱ水平分別為（26.2±15.60）U/L和（48.4±19.55）U/L。MF組與AF組TGF-β1水平分別為（20.55±10.62）ng/mL和（25.65±14.45）ng/mL。AF組血清Ang Ⅱ及TGF-β1顯著高于MF組（P<0.05）。見表3。

2.4 肝組織免疫組化學分析

Ang Ⅱ及TGF-β1陽性為胞漿型，呈黃色或棕黃色（封三圖1）。隨著纖維化程度加深，Ang Ⅱ及TGF-β1陽性表達呈遞增趨勢。

3 討論

肝纖維化是乙肝發展為肝硬化必經的病理過程，由于肝臟中細胞外基質（extracellular matrix，ECM）增生與降解失衡，進而導致肝臟內纖維結締組織異常沉積的結果。其中肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化的細胞學基礎，其活化是肝纖維化形成的開端[6]。HSC活化受一系列細胞信息分子和細胞內信號轉導的調控，作用于這些信號及其轉導過程或阻斷這些信號轉導級聯反應的主要環節，已成為防治肝纖維化的重要策略[7]。

長期以來，肝穿刺活檢一直作為診斷肝纖維化的金標準。但由于肝活檢是一種創傷性檢查，存在一定風險，且受標本誤差的影響。盡管慢性肝炎、肝纖維化是肝臟彌漫性病變，但其病變的程度分布不均勻，1份肝活檢標本僅占肝臟的1/100000～1/50000，難免存在樣本的誤差[8]。因此亟需發現可以早期協助診斷肝纖維化的指標。有研究表明，慢乙肝患者血漿ACE的水平可作為肝纖維早期指標[9]。

傳統的觀念認為：腎素-血管緊張素-醛固酮系統（Renin-angiotension-aldosterone System，RAAS）是一個循環的內分泌系統。近年陸續研究發現，肝臟中也存在完整的RAAS生化鏈，且與肝纖維化密切相關[10]。血管緊張素Ⅱ（Angiotensin，Ang Ⅱ）是RAAS系統的主要生物活性物質，它需與細胞膜上的Ang受體（ATR）結合后才能發揮作用[11]。AngⅡ主要通過以下信號轉導途徑將上游信號傳遞至下游的應答分子：（1）AngⅡ與AT1R結合后，使ERK和c-jun磷酸化，從而激活Ras/ERK信號通路[12]；（2）AngⅡ通過激活還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶，產生活性氧簇，進一步激活Ras/ERK、PI3K/Akt 等信號通路；（3）AngⅡ還可使細胞內Ca2+濃度升高，調節細胞內pH傳遞信號[13]。當肝臟受到各種損傷因子作用時，AngⅡ除通過上述信號通路使HSC活化外，還可通過增加HSC的TGF β1表達促進HSC激活[14]。

轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）作為TGF-β家族中的重要組成成員，在肝纖維化的發生、發展中起著至關重要的作用，是目前公認的最強的致纖維化細胞因子[15]。Akpolat等[16]運用免疫組化方法對CHB患者肝組織中TGF-β1分布和含量進行分析，發現正常肝組織中TGF-β1表達量極少，但肝纖維化時可在肝竇內皮細胞、纖維間隔等部位表達，并且其含量與肝纖維化程度呈正相關，這與國內外大量相關研究結論一致。HSC激活成為肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）進而產生大量ECM是形成肝纖維化的中心環節[17]。TGF-β1可直接作用于HSC或通過誘導HSC表達血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等細胞因子受體使HSC激活為MFB，導致ECM的合成和分泌能力增加，而HSC激活后又可分泌TGF-β1，形成TGF-β1與HSC激活之間的惡性循環，使ECM生成進一步增多[18-20]。

本研究通過肝臟病理活檢顯示，Metavir評分較高者，其纖維化程度較高的，相對應的血清及肝臟中AngⅡ、TGF-β1水平也較高。由此提示AngⅡ、TGF-β1參與了肝臟纖維化進程。相較于肝穿刺活檢的有創風險及標本誤差，檢測血清AngⅡ、TGF-β1水平則安全、快速、簡便，這提示RAAS信號通路及TGF-β1有可能成為防治肝纖維化的一個重要靶點。

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（收稿日期：2017-07-14）endprint