應用蠶豆微核技術監測渭河寶雞段水質污染狀況

李愛玲+賈盼

摘要：采用蠶豆根尖細胞微核技術，對渭河寶雞段的上、中、下游水樣進行檢測。結果表明，渭河寶雞段上、中、下游水樣的微核率平均分別為1.23‰、1.65‰和1.74‰；污染指數分別為1.84（輕度污染）、2.46（中度污染）和2.60（中度污染）。隨著水污染程度的加重，過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）呈升高趨勢。

關鍵詞：蠶豆；渭河；微核率；污染指數

中圖分類號：X522；X132 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4727-04

寶雞市依托渭河而立，是中原通往西南、西北的交通樞紐，陜、甘、川、寧四省（區）毗鄰地區的商貿和物流中心，是西部大開發承東啟西的重要支點。

目前，對水體監測有多種方法，而微核試驗是根據被打斷的DNA分子或由紡錘絲斷裂造成整條染色體落后于核分裂形成微核的現象來檢測某些理化因素造成遺傳損傷的一種簡便、快速的遺傳毒理學研究方法。微核試驗具有敏感度高、快速經濟、不需要精尖技術等優點，在環境監測中應用較為廣泛[1-3]。蠶豆根尖微核試驗是世界范圍內推廣運用的環境致突變性檢測技術，20世紀80年代初，世界衛生組織（WHO）、聯合國環境署（UNEP）和美國國家環保局（USEPA）相繼確定了蠶豆根尖微核試驗在環境化學物致突變性檢測中的作用，并建議在全世界范圍內推廣[4-6]，1986年，被中國環保局列為水環境生物測試的規范方法，用于檢測水體的致突變性[7]。

隨著城市人口的增加、工農業的快速發展，渭河水質污染問題已引起社會各界的廣泛關注。對渭河水質污染狀況的研究，通常利用常規物理化學手段進行監測，而有關生物學技術監測污染情況的研究鮮有報道。本研究采取渭河寶雞段上、中、下游水樣分別對蠶豆進行處理，通過測定蠶豆根尖細胞的微核率、污染程度和過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的變化，并結合各采樣點河段污水排放情況，綜合評價了渭河寶雞段的水質污染狀況，為有效開展水體污染監測、農田灌溉等水污染引起健康危害的預防提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 西安市售優質青皮蠶豆；環磷酰胺，上海第十二制藥廠；H2O2測定試劑盒（比色法）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒（羥胺法）、MDA測定試劑盒（TBA法）和SOD測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；改良苯酚品紅染色液，北京雷根生物技術有限公司。其他常用試劑為分析純或生化試劑。

1.1.2 儀器 數碼顯微攝影系統（Leica DM750），徠卡公司和聯想（北京）有限公司；數顯恒溫水浴鍋，上海躍進醫療器械有限公司；臺式離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；721型分光光度計，上海棱光技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水樣采集 渭河寶雞段主要接納工業廢水和居民生活廢水，周圍有居民聚集區、工業廠房等建筑，附近還有山脈、森林等自然環境。2015年9月，依據渭河水質狀況及兩岸污染源，分別取渭河寶雞段上、中、下游水樣，每樣點采集水樣1 000 mL，于4 ℃冰箱避光保存，用于蠶豆根尖細胞微核檢測。同時觀察記錄水質表觀特征及兩岸污染源情況。

1.2.2 微核試驗 選取無蟲害、無霉變的飽滿蠶豆，試驗操作步驟和方法見參考文獻[8，9]，分別用渭河寶雞段上、中、下游水樣培養蠶豆根尖作為試驗組；陰性對照為自來水培養的蠶豆根尖；陽性對照為 2 mg/L環磷酰胺培養的蠶豆根尖。

1.2.3 微核率統計 玻片的編號與計數采用盲法。計數時，選取涂片及染色質量好的區域，避開過分重疊和細胞破壞的區域。微核直徑小于主核的1/3，結構和顏色深淺同主核相似，轉動顯微鏡微調時，與主核處于同一水平面。每個試驗組鏡檢5個以上的根尖，每個根尖至少觀察1 000個分散良好、質核清晰的間期細胞，統計微核細胞數。每個試驗組統計3次，取平均值，計算微核率，微核率（MCN）=微核個數/觀察細胞總數×1 000‰[10]。

根據國家環境保護總局用蠶豆根尖微核試驗對水質污染評價的“污染指數”概念，水體受污染程度采用污染指數（PI=待測水樣微核率/陰性對照組微核率）來劃分[7]。

1.2.4 過氧化氫、超氧化物歧化酶和丙二醛含量的測定 以蠶豆胚根為材料，H2O2、MDA和SOD測定采用南京建成生物工程研究所相應的試劑盒，按照說明書所述步驟進行操作。觀察、測試和分析均重復3次。

1.2.5 數據分析 用GraphPad Prism 5軟件進行作圖；用SPSS 19.0軟件對各組樣本的平均微核數進行t檢驗，并檢測不同處理組與陰性對照組的差異顯著性[11，12]。

2 結果與分析

2.1 渭河寶雞段水質污染狀況

由表1可知，陰性對照組微核率為0.67‰，陽性對照組微核率為9.67‰。因不同試驗材料監測的結果有很大差異，故較低的微核率是試驗成功的關鍵因素之一。根據1986年頒布的《環境監測技術規范》規定，作物微核率不應高于10.00‰[7，13]，本研究中，各試驗組的微核率都在10.00‰以下，符合污染檢測要求。渭河寶雞段各水樣處理蠶豆根尖后，都出現了不同程度的微核（圖1），上游水樣處理組的微核率為1.23‰，污染指數是1.84，為輕度污染；中游水樣處理組的微核率為1.65‰，污染指數是2.46，為中度污染；下游水樣處理組的微核率為1.74‰，污染指數是2.60，為中度污染。各試驗組的微核率都明顯高于陰性對照組，且上游、中游至下游蠶豆根尖微核率和污染指數都呈上升趨勢。用SPSS 19.0軟件對表1數據進行t檢驗，結果表明，上游水樣微核率顯著高于陰性對照組（P<0.05），中、下游水樣微核率都極顯著高于陰性對照組（P<0.01）。endprint

2.2 過氧化氫、超氧化物歧化酶和丙二醛含量的變化

植物在逆境脅迫或衰老過程中，細胞內活性氧代謝的平衡被破壞而有利于活性氧（ROS）的積累，H2O2便是活性氧之一。由圖2可知，蠶豆胚根陰性和陽性對照組H2O2含量分別為1.335和7.463 mmol/g；上游、中游和下游水樣蠶豆胚根的H2O2含量分別為2.442、3.456和4.578 mmol/g。上游和中游水樣蠶豆胚根的H2O2含量顯著高于陰性對照組（P<0.05）；下游水樣H2O2含量極顯著高于陰性對照組（P<0.01）。

MDA是細胞膜脂過氧化作用的產物之一，測定其含量可以評價質膜受損程度。陰性和陽性對照組蠶豆胚根的MDA含量分別為7.153和23.792 nmol/mg；上游、中游和下游水樣蠶豆胚根的MDA含量分別為8.873、12.962和18.357 nmol/mg。上游水樣蠶豆胚根的MDA含量與陰性對照組無顯著差異，中游和下游水樣MDA含量顯著高于陰性對照組（P<0.05）。

陰性和陽性對照組蠶豆胚根的SOD活性分別為653和706 U/g蛋白；上游、中游和下游水樣蠶豆胚根的SOD活性分別為732、861和753 U/g。上游和下游水樣SOD含量與陰性對照組無顯著差異，中游水樣SOD含量極顯著高于陰性對照組（P<0.01）。

3 小結與討論

微核的形成體現了環境的污染狀況，反映了細胞遺傳物質損傷的程度，而遺傳物質損傷又是機體癌變的原因之一，因此微核試驗被認為是反映機體接觸“三致”物質的敏感指標之一[5，14]。蠶豆根尖對各種誘變因子反應十分敏感，當誘變因子劑量在一定范圍內時，微核產生的數量與誘變因子的劑量呈正比。Dong等[15]認為焦化廢水可誘導蠶豆和大麥根尖細胞產生微核，并呈劑量依賴關系，且蠶豆比大麥更靈敏。Shahid等[16]用土壤中的有機金屬混合物來培養蠶豆，檢測其微核率，確定土壤的質量和其對植物的遺傳毒性。趙志國等[17]利用蠶豆根尖微核技術檢測長江涪陵段水質，以不同取水點對蠶豆根尖進行染毒處理，表明長江涪陵段水質受到了不同程度的污染，靠近城區和工廠附近的污染尤其嚴重。沒有細胞的分裂活動，即使毒性很強的遺傳毒物，也無法通過染色體畸變、微核等細胞遺傳學的手段監測[18]，所以在利用細胞遺傳毒理學進行監測時，必須保證測試材料具有一定的細胞分裂水平，這是正確檢測的必要條件。

近年來植物毒性試驗作為一種對環境污染物毒性檢測和評價的方法越來越受到人們的關注，本研究以蠶豆為材料，研究了污水對蠶豆根尖細胞微核率、H2O2、MDA含量及SOD活性的影響，旨在為污水的毒性檢測、安全排放及生物監控指標的確定提供一定的理論依據。本研究結果表明，在污水成分的脅迫下蠶豆胚根生長發育異常，出現生長緩慢、褐化、彎曲生長、根尖壞死等癥狀。通過檢測，H2O2和MDA都呈升高趨勢，這與徐秋曼等[19]、劉會杰等[20]的研究結果一致。即隨著水污染程度加重，H2O2等活性氧（ROS）積累，未被及時清除的過量H2O2等ROS作用于DNA分子而導致染色體斷片，進而形成微核。MDA升高則意味著細胞膜脂過氧化的程度增加，膜損傷加劇。本研究中SOD活性先升后降，這可能與抗氧化酶參與污水脅迫的抵抗有關，是植物體對外界環境變化的一種響應。

試驗所取渭河寶雞段上、中、下游水樣的污染程度表現為下游=中游﹥上游，即渭河水流經寶雞市之前就已有一定程度的污染，流經該市區時，河水又受到了污染。這與水樣所處地理位置、沿途接納兩岸工農業廢水和生活污水有關。通過對渭河寶雞段水樣的檢測表明，水體中具有一定的遺傳毒性，可顯著誘導蠶豆根尖細胞微核率的上升。造成此種結果的原因是在林家村水壩（上游）附近，農業種植面積較大，農業種植施用化肥及農村養殖造成的污染加劇；在渭河大橋（中游）和潘家灣大橋（下游），由于造紙、化工等工廠集中，受工業廢水的影響，水中化學成分十分復雜，水質進一步下降。且由于居民區集中，一些配套污水管網和污水處理設施建設滯后，生活污水處理達標率低。生活污水和垃圾較多，對水體污染程度較高。盡管水流自身具有自凈能力，但枯水期生態水嚴重不足，造成生態基流短缺，水體自凈能力難以充分發揮，直接影響渭河水質。

渭河作為關中地區的“母親河”，影響著關中地區的農業經濟社會發展，而人類的經濟生產、生活活動也影響著渭河水質的變化，水污染又會間接威脅到人們的健康。改善渭河流域水生態環境，是貫徹落實黨中央、國務院提出的經濟、社會、環境協調發展戰略的客觀要求，對于渭河流域經濟社會可持續發展具有重要意義。目前，各部門聯合作戰，對渭河寶雞市區段實施改造、提升，進行渭河綜合治理、河道生態治理，旨在建立親水、生態、環保、景美的新河道。

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