草魚養(yǎng)殖池噬菌蛭弧菌的分離與鑒定

陳煜安

摘要：利用雙層平板法，以嗜水氣胞菌（Aeromonas hydrophila）為宿主菌，從草魚養(yǎng)殖池水中分離蛭弧菌一株；根據(jù)蛭弧菌hit基因序列設(shè)計引物進行PCR擴增，所得產(chǎn)物經(jīng)膠回收、測序比對，發(fā)現(xiàn)其序列與噬菌蛭弧菌的hit基因100%同源，表明所分離得到的為噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）。

關(guān)鍵詞：噬菌蛭弧菌；分離；鑒定；PCR

中圖分類號：S943 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4737-03

噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）是一類由Stolp等[1]于1962年首次發(fā)現(xiàn)的、原核生物界惟一一類周質(zhì)型專性捕食性細菌。其體形小，在土壤、淡海水、污水等不同生境中分布廣泛，且運動活潑，具有“寄生”和“裂解（溶菌）”宿主菌的生物學(xué)特性[2-4]。

近年來，隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展及養(yǎng)殖水體的污染，嗜水氣單胞菌等革蘭氏陰性病原菌對草魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物造成了嚴重的危害[5-7]。蛭弧菌能寄生和裂解大多數(shù)種類的革蘭陰性菌。鑒于這一特性，噬菌蛭弧菌受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中一種良好的微生態(tài)制劑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)學(xué)等不同領(lǐng)域均顯示出廣闊的應(yīng)用前景[8-12]。

本研究利用雙層平板法從草魚養(yǎng)殖池水中分離得到蛭弧菌一株，根據(jù)噬菌斑形成等對其進行初步的鑒定，同時根據(jù)蛭弧菌的Host interaction（hit）基因序列設(shè)計了特異性引物[13，14]，從分子水平上對該菌株進行鑒定，以期為該菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治等理論研究與實踐應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣 采自紹興皋埠鎮(zhèn)某草魚養(yǎng)殖池，用采水器從底部取水，裝于50 mL滅菌的離心管中。

1.1.2 宿主菌株 以紹興魯迅中學(xué)實驗室分離自患病草魚并保存的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為宿主菌。

1.1.3 培養(yǎng)基 雙層培養(yǎng)基：上層為0.6%自來水瓊脂，用于蛭弧菌篩選、分離和純化；下層為1.5%自來水瓊脂；普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉15 g，瓊脂1.5 g，無菌水加至1 000 mL，pH 7.0；浸出液（NB液體培養(yǎng)基）：上述普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基不添加瓊脂。

1.1.4 主要試劑 Taq酶、dNTPs購自生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒購自愛思進公司；pGMT載體、大腸桿菌感受態(tài)等均購自天根公司；其他為國產(chǎn)分析純。

1.2 噬菌蛭弧菌的分離與鑒定

1.2.1 宿主菌懸液的制備 將宿主菌嗜水氣單胞菌接種于NB平板上，30 ℃過夜培養(yǎng)，刮取、無菌水洗脫細菌并收集于5 mL離心管中，10 000 r/min，室溫離心2 min，去上清液，加入3 mL無菌水制備成菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛭弧菌的分離與純化 樣品處理：取池水，經(jīng)8層紗布過濾，得澄清液置超速冷凍離心機中離心（4 ℃，30 000 r/min，40 min）；沉淀用5 mL無菌水溶解，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后備用。

蛭弧菌的分離、純化：取1 mL濾液加入2 mL的宿主菌懸液，混勻；然后加入0.6%自來水瓊脂培養(yǎng)基共7 mL（滅菌并保持在48 ℃左右），搖勻后倒置在經(jīng)滅菌的1.5%自來水瓊脂固體培養(yǎng)基上。30 ℃下倒置培養(yǎng)，觀察噬菌斑的形成；經(jīng)2～4 d的培養(yǎng)，刮取平板上透明、圓形和整齊的單個噬菌斑，置于NB液體培養(yǎng)基的離心管中，浸泡10 min以上；用浸出液做雙層平板，重復(fù)傳代3次以上獲得純化的蛭弧菌。

1.2.3 蛭弧菌的PCR鑒定 在結(jié)合以上噬菌斑進行鑒定的基礎(chǔ)上，根據(jù)文獻報道[13，14]及GenBank中蛭弧菌hit基因的序列，利用Oligo 6.5軟件設(shè)計特異性引物，BDhitf：5′-GTGGCTTCAAACGGAGTGGA-3′，BDhitr：5′-ACGACTGTGAACGGCAACG-3′。PCR擴增體系：DNA模板（噬菌斑浸出液）2.0 μL，Taq酶0.2 μL，dNTPs 0.4 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，引物各1.0 μL，無菌水17.9 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結(jié)果，PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后，與T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞；陽性克隆經(jīng)鑒定后送生物工程（上海）股份有限公司測序，用Blast和Clustal W2軟件進行序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛭弧菌的分離結(jié)果

采用雙層瓊脂平板法，以嗜水氣單胞菌為宿主菌，通過濾膜過濾的方法收集草魚養(yǎng)殖池池水培養(yǎng)蛭弧菌。結(jié)果如圖1所示，從2 d時開始形成大小相似、直徑約0.10～0.25 cm的圓形、透明、邊緣整齊、凹陷的噬菌斑“負菌落”；3 d后出斑率較高，直至7 d左右，其大小總體上隨培養(yǎng)時間延長而增大，顯示所分離的蛭弧菌具有明顯的噬菌作用。挑選特征典型的噬菌斑進行傳代，經(jīng)4次傳代后得到蛭弧菌一株，命名為BD-sx1（圖1）。

2.2 蛭弧菌的PCR鑒定

在利用噬菌斑等形態(tài)學(xué)指標和噬菌特性對分離到的蛭弧菌進行初步觀察與鑒定的基礎(chǔ)上，以宿主嗜水氣單胞菌和大腸桿菌DH5α為陰性對照，進行PCR擴增反應(yīng)。結(jié)果（圖2）顯示，只有蛭弧菌菌株BD-sx1中獲得近800 bp的擴增條帶，大小與預(yù)期相符。進而對PCR擴增產(chǎn)物進行割膠回收，純化產(chǎn)物與T載體連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，對經(jīng)鑒定后的陽性克隆進行測序，經(jīng)Blast和Clustal W2軟件與GenBank中已知的蛭弧菌hit基因序列比對分析，結(jié)果表明，所得基因序列與噬菌蛭弧菌的hit基因序列100%相似（圖3），進一步證明本研究所分離、純化到的蛭弧菌菌株BD-sx1為噬菌蛭弧菌。endprint