尼泊金酯作為防腐劑在芽孢桿菌中的應用

陳偉+周榮華+廖先清+劉芳+張光陽+饒犇

摘要：研究了尼泊金酯作為防腐劑對蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）芽孢萌發的抑制作用和對伴孢晶體的影響。結果表明，尼泊金乙酯對蘇云金芽孢桿菌芽孢萌發有較強的抑制作用，在0.05%低劑量下即可有效抑制芽孢的萌發。SDS-PAGE分析和生物測定表明，尼泊金乙酯對伴孢晶體無顯著損傷作用，在0.10%條件下放置3周，發酵液毒力還保持在85%。

關鍵詞：尼泊金酯； 防腐劑； 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）

中圖分類號：TS202.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4782-02

尼泊金酯是一種廣譜性高效食品防腐劑，國際上廣泛應用于調味品、糕點餡料、檳榔、乳制品、豆制品、肉制品、飲料、魚類制品、果蔬等食品的防腐保鮮[1-5]。尼泊金酯及其鈉鹽系列產品有尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯及尼泊金甲酯鈉、尼泊金乙酯鈉、尼泊金丙酯鈉、尼泊金丁酯鈉，均有良好的防腐效果[6-9]，具有防止發酵、抑制細菌增殖和殺菌能力，能夠鈍化酶的活性，阻止微生物新陳代謝的某些環節，在一定濃度下對一些微生物的生長有抑制或者殺滅作用。在芽孢桿菌的水劑懸液中加入適當的尼泊金酯作為防腐劑，既可以阻止二次發酵，也能抑制一些雜菌的生長，從而維持菌懸液的穩定性。本試驗研究尼泊金酯作為防腐劑對幾種常用的芽孢桿菌水劑產品的作用，為后續產品開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：湖北省生物農藥工程研究中心研究室分離和保存的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。培養基：LB培養基（蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g）；發酵培養基（淀粉10 g，豆粕10 g，酵母粉5 g，玉米漿5 g，pH 7.2）。藥品：尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、山梨酸鉀、苯甲酸鈉均購自國藥公司。

1.2 方法

發酵：將蘇云金芽孢桿菌接種至LB培養基，培養12 h后接種至發酵培養基，當菌體形成芽孢和晶體后，4 ℃保存備用。

尼泊金酯處理芽孢：將一定量的尼泊金酯加入裝有10 mL的LB培養基的試管中，以未加尼泊金酯的試管作為對照。以1%比例接種各種芽孢桿菌的菌懸液，搖勻后30 ℃培養。每隔一段時間檢查芽孢的萌發情況；對芽孢沒有萌發的培養液稀釋涂平板，分析芽孢是否被殺死。

尼泊金酯處理蘇云金芽孢桿菌晶體：用天平稱取一定量伴孢晶體懸浮于1 mL無菌水中，加入尼泊金酯，以未加伴孢晶體作為對照，振蕩后30 ℃放置，進行SDS-PAGE測定。

尼泊金酯防腐防霉試驗：將一定量的芽孢桿菌發酵液裝入塑料瓶中，分別加入一定的尼泊金酯，45 ℃下放置，定期鏡檢雜菌生長，觀察發酵液氣味變化，測定發酵液的毒力以及芽孢的情況。

生物測定：以經驗致死中濃度作為參照，將各處理發酵液以1.8倍稀釋成不同濃度菌懸液，晾干。以1齡末棉鈴蟲作為供試昆蟲，每個處理重復3次，每次接種30頭，另置清水對照，25 ℃培養，處理4 d檢查死、活蟲數，計算LC50。

2 結果與分析

2.1 尼泊金酯對芽孢桿菌芽孢的抑制作用

由表1可知，尼泊金乙酯在0.05%的劑量下 14 d內可以抑制芽孢的萌發；在0.10%的劑量下30 d內可以抑制芽孢的萌發。尼泊金丙酯則在0.05%的劑量下7 d內可以抑制芽孢的萌發，0.10%的劑量下14 d內可以抑制芽孢的萌發。作為對照，苯甲酸鈉在0.05%的劑量下7 d內可以抑制芽孢的萌發，0.10%的劑量下14 d內可以抑制芽孢的萌發。表明尼泊金乙酯對芽孢萌發的抑制作用較好。

為明確尼泊金乙酯是否將蘇云金芽孢桿菌殺死還是只是抑制芽孢萌發，將上述用尼泊金乙酯處理28 d的芽孢用無菌水反復洗滌離心多次，除去其中的尼泊金乙酯，將洗滌好的芽孢稀釋涂平板，30 ℃培養24 h。1 d后，芽孢萌發，說明尼泊金乙酯并未殺死芽孢本身；涂片和顯微鏡觀察，芽孢經過處理后，萌發產生的芽孢及晶體形狀沒有發生改變，且芽孢與晶體的數量相當，表明尼泊金乙酯未使蘇云金芽孢菌株發生變異。接著考察尼泊金乙酯對蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的作用，SDS-PAGE表明尼泊金乙酯對晶體無損傷作用。

2.2 尼泊金乙酯的防腐防霉能力

在前期研究尼泊金乙酯對蘇云金芽孢桿菌芽孢及其伴孢晶體基礎上，于50 ℃條件下放置，7 d后顯微鏡檢查，除發酵液空白對照外，未添加尼泊金乙酯的發酵液表面出現較多霉菌，而添加0.10%劑量尼泊金乙酯的發酵液未污染雜菌；14 d后，未添加尼泊金乙酯的發酵液已完全污染，而添加0.10%劑量尼泊金乙酯的發酵液正常，無污染出現；28 d后，未添加尼泊金乙酯的發酵液已發臭，鏡檢全部是霉菌和桿菌等雜菌，而處理過的發酵液正常，無異味散出。

2.3 尼泊金乙酯作為防腐劑Bt發酵液毒力穩定性

生物測定添加尼泊金乙酯的蘇云金發酵液在50 ℃條件下的毒力變化情況。結果表明，添加0.05%尼泊金乙酯的發酵液毒力穩定性一般，50 ℃下放置7 d后毒力保持率為80%，14 d后還有50%，21 d后則只有30%；而添加0.10%尼泊金乙酯的發酵液毒力穩定性非常好，50 ℃下放置7 d后毒力保持率為95%，14 d后還有90%，21 d后則只有85%。

3 小結與討論

本研究結果表明，尼泊金乙酯在0.10%的劑量下可在30 d內有效抑制蘇云金芽孢桿菌芽孢的萌發，但未殺死芽孢，有效防止了其二次發酵；SDS-PAGE分析表明，尼泊金乙酯對伴孢晶體并無明顯損傷作用，且毒力保持良好，是良好的蘇云金芽孢桿菌防腐劑，可以一定程度上代替苯甲酸鈉。

參考文獻：

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