白及組織培養的建立與快速繁殖研究

陳巧玲+楊國才+程群+高劍華+徐怡

摘要：以白及（Bletilla Reichb.f.）種子為外植體，通過不同的培養基進行愈傷組織誘導培養與繼代生根培養，研究白及種子快速繁殖的最優培養基配方。結果表明，愈傷組織誘導培養最佳培養基組合為液體培養基1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+6.0 mg/L IAA+pH 8.2；在植物生長調節劑6-BA與NAA愈傷組織液體誘導培養中以1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+pH 5.8最佳；MS+pH 5.8培養基對生根較好，1/2 MS+pH 5.8對叢生芽的增殖較好；試驗為白及建立植株繁殖體系提供了科學依據。

關鍵詞：白及（Bletilla Reichb.f.）； 種子；組織培養；快速繁殖；培養基配方

中圖分類號：S567.23+9.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4807-04

白及屬（Bletilla Reichb.f.）為蘭科（Orchidaceae）多年生草本植物，地下部分具肥厚的肉質根狀莖或假鱗莖；作為中藥材有3個種，分別是華白及[B.sinensis（Rolfe）Schltr.]、黃花白及（B.ochracea Schltr.）和小白及[B. formosana（Hayata）Schltr.][1，2]。白及假鱗莖含白及膠質（白及甘露糖）黏液（約55%），還含淀粉揮發油等成分[3]。可用于癰疽瘡腫、跌打損傷、刀箭創傷及燙火傷治療，能生肌止痛，具美容作用，治面部痤瘡、除疥廯、止肺部出血等[4]。其不僅具有醫藥用途，同時也有極高的觀賞價值。白及在每年的9-10月蒴果由淡黃到褐色而成熟，然后破裂，散出種子；但白及的種子在自然環境中幾乎不萌發，可能與種子發育不完整有關。目前白及的栽培主要采用分株繁殖方式，繁殖系數低，生長周期較長，不宜進行大規模的商業化生產。隨著植物組織培養技術的發展，白及的試管繁殖已成為可能。已經有選用白及種子進行無菌播種、初代培養、繼代培養、壯苗培養、生根培養、移栽培養的報道[5]，還進行了白及共生菌的分離、初步鑒定和伴生菌研究，這為建立完善的白及快繁體系奠定了技術基礎，對擴大白及栽培規模、滿足市場需求以及保護野生資源[6]都具有重要意義。有學者已在白及組織培養方面進行了實踐，如曾宋君等[7]做了白及無菌播種及試管苗莖尖組織培養；田英翠等[8]進行了白及組織培養快繁技術研究；石云平等[9]以白及側芽為外植體，進行白及組織培養快速繁殖技術研究，為人工栽培提供了大量種苗；余朝秀等[10]認為煉苗基質以60%腐葉土+30%珍珠巖+10%素紅土為佳，煉苗溫度23～27 ℃，空氣相對濕度在80%～90%有利于提高煉苗成活率。試驗采用未成熟的白及蒴果進行無菌播種培養和試管苗的組織培養，著重研究并篩選白及組織培養的最佳培養基配方及培養程序，旨在建立無性繁殖體系，探索脫毒白及生產快速繁殖技術，這不但能在短期內獲得大量的無病毒種苗滿足市場需求，而且通過放養有利于白及野生資源的保護。

1 材料與方法

1.1 材料

白及種子以及植物生長調節劑NAA、6-BA、IAA由恩施州農業科學院實驗室提供；選取白及種子作為外植體，流水沖洗2 h后用濾紙吸干水分，在超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s左右，然后用0.1%的升汞振蕩消毒3 min，去離子水清洗5次，再接種到培養基中。

1.2 方法

1.2.1 外植體誘導愈傷組織正交試驗 以白及種子為試驗材料，選用MS培養基為基礎培養基，MS培養基母液的配制及保存參考文獻[11]的方法。以植物生長調節劑、瓊脂、pH和MS稀釋倍數4因子、3水平設計L9（34）正交試驗，具體見表1。每個處理10次重復， 培養條件為溫度25 ℃、光照度1 500～2 500 1x、每天光照24 h。通過以上處理誘導出愈傷組織后，進行下一步繼代培養及叢生芽增殖培養。

1.2.2 繼代與生根培養 愈傷組織繼代與生根培養采用4組培養基，各組培養基配方如下：Ⅰ組固體培養基、液體培養基為MS+pH 5.8；Ⅱ組固體培養基為MS+0.5 mg/L NAA+pH 5.8；Ⅲ組固體培養基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+pH 5.8；Ⅳ組固體培養基、液體培養基為1/2 MS+pH 5.8。每組10次重復，比較各組對白及愈傷組織繼代與生根培養的影響。

1.2.3 增殖培養 對繼代與生根培養出來的外植體通過誘導培養基分別增殖培養，使已分化的外植體再次脫分化，誘導出更多的叢生芽。以1/2 MS （pH 5.8）為基礎培養基，添加不同組合的6-BA、NAA，各處理組合見表2，每處理10個重復。比較不同植物生長調節劑對叢生芽增殖的影響。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導培養

L9（34）正交試驗結果見表3。從表3中可以看出，白及愈傷組織生長狀況與瓊脂數量關系密切，在瓊脂為0的處理中，愈傷組織誘導成活率較高，其次是與MS培養基稀釋倍數相關。在瓊脂為0（即液體培養基）的處理1、處理4、處理7這3個處理中，愈傷組織誘導成活率分別為80%、70%、90%，均處于較高水平；從表3中還可以看出，1/2MS培養基的處理（處理2、處理6、處理7）其愈傷組織具有較高的誘導成活率，分別為70%、50%、90%。最佳的為處理7，即1/2 MS+6.0 mg/L IAA+1.5 mg/L 6-BA+0 g瓊脂+pH 8.2，其誘導成活率為90%。

2.2 繼代與生根培養

白及愈傷組織繼代與生根培養的試驗結果分別見圖1、圖2、圖3、圖4。對繼代與生根培養的Ⅰ組與Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ組生長情況進行單一比較，以及Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅲ組、Ⅳ組兩兩之間進行生長情況比較，結果見表4。從圖1、圖2、圖3、圖4、表4可知，在Ⅱ組、Ⅲ組中加入了0.5 mg/L NAA 后，根的產生極少，說明NAA對根的生長具有抑制作用，且對外植體的伸長生長也有抑制作用；1/2 MS培養基培養利于白及外植體不定芽的形成，進而可形成其他器官[12]；MS利于白及外植體根及地上部分的形成。endprint

2.3 植物生長調節劑對增殖培養的影響

植物生長調節劑誘導白及叢生芽增殖的情況見圖5。由圖5可以看出，生長最佳的是A2組、A4組、C4組，其培養基組成分別為1/2 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+pH 5.8、1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+pH 5.8、1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+pH 5.8；以A4組的叢生芽增殖成活率最高，達85%。從圖5還可見，由A2組至B3組叢生芽的增殖成活率是遞減的，而從B3組至A4組則呈現出遞增的變化趨勢，隨著6-BA、NAA單因素各濃度的增加，叢生芽增殖成活率有增有減。說明低濃度的6-BA、NAA與高濃度的6-BA、NAA均有利于叢生芽進一步向莖葉方向的分化，這可能跟低濃度的植物生長調節劑有利于植株的生長、高濃度的植物生長調節劑會導致植株死亡有關[13]。

3 小結與討論

3.1 種子組織培養與種子萌發優劣比較

本次試驗培養出來的白及幼苗采用的種子也許會有種子本身萌發潛力[14]的干擾，為此，將其與種子萌發做一比較。首先，種子萌發注重種子的完整性，種子的結構不完整以及生理準備物質不足將使繁殖系數極低，影響整個植株的生長潛力。而采用組織培養不但可以避免這方面的不利，并且可以通過重復使誘導出來的愈傷組織建立起量大的繁殖體系，這就大大提高了繁殖系數。其次，自然狀態下，白及種子極小，加之會遇到惡劣的自然環境，用種子很難繁殖出新的植株；而組織培養可在室內進行大量繁殖，通過煉苗，提高了植株對外界不良環境的抵御能力。

3.2 瓊脂濃度與白及愈傷組織形成及發育的關系

培養過程中發現，在瓊脂濃度相對較低的培養瓶中外植體容易形成比較好的愈傷組織，愈傷組織膨大、團狀；在瓊脂濃度相對較高的培養瓶里愈傷組織相對較小。這一現象的原因可能是：第一，在一定營養成分濃度的培養環境中，有利于愈傷組織的形成，不管是何種成分，只要濃度達到，產生有利于愈傷組織形成的膨壓（位置效應）[15]，就能誘導愈傷組織的形成；第二，跟瓊脂本身一定濃度的成分相關，瓊脂中的某些成分在其濃度較低時，促進愈傷組織的形成，從而誘導細胞分裂；第三，培養基的凝膠狀態模擬了細胞的內環境，利于細胞的分裂、分化。

3.3 外植體成活率隨著培養時間的延長而遞減

外植體隨著培養時間的延長，成活率呈遞減趨勢，其原因有二：一是外植體本身具有一定的營養物質，培養于另一培養基里時，自身的營養物質或生長調節物質可維持其生長一段時間；二是培養基中的營養物質有限，外植體在增殖的過程中大量消耗營養，營養物消耗殆盡時，植株的成活率自然降低。

3.4 外植體聯合現象

在少部分愈傷組織中發現，培養一段時間后，各個獨立的愈傷組織出現聯合生長[16]的現象，進行繼代培養時，聯合的愈傷組織猶如一個沒分開過的整體，出現一部分長莖、一部分長根的現象。這種現象出現的可能原因：一是外植體的同源性，外植體均為同種親本，又處于愈傷組織環境中，具有識別作用的糖蛋白相同；二是細胞間的融合作用。依據此現象可以對外植體形成的愈傷組織分開進行不同的誘導方向培養，讓其一部分長莖、長葉，一部分長根，一部分依然是愈傷組織；待長出不同的器官后，在同一培養基中進行誘導融合培養，發揮愈傷組織起聯合的橋梁作用。

3.5 培養基物理狀態對組織培養的影響

從整個試驗處理來看，當用于愈傷組織的誘導培養時，液體培養的效果明顯高于固體培養；當用于繼代培養時，固體培養的效果又相對較好，使植株生長健壯。原因可能是液體具有流動性，外植體吸收養分更方便、更快捷，提供了有利于細胞增殖的環境；固體利于繼代培養可能是固體對外植體的分化提供了一個理想的分化環境，對外植體還具有固定作用，使細胞的分化能夠穩定進行；此外，這里的固相屬于凝膠狀態，具有跟細胞液相似的內環境，從而使分化更容易進行。

試驗通過L9（34）正交設計，篩選出最佳誘導白及種子愈傷組織的培養基配方為1/2 MS+6.0 mg/L IAA+1.5 mg/L 6-BA+0 g瓊脂+pH 8.2，瓊脂濃度為零即培養基的狀態為液體狀態；此外，在繼代培養后又進行的叢生芽增殖培養中，誘導出的叢生芽生長最好的培養基配方仍為液態下的誘導培養基，其配方分別為1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+ pH 5.8、1/2 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+pH 5.8、1/2 MS+4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+pH 5.8，它們均有利于白及種子愈傷組織形成后的叢生芽增殖，說明NAA與6-BA不同濃度的配比對白及種子愈傷組織的誘導成活率和叢生芽增殖存在著協同效應。MS+pH 5.8培養基對生根作用較好，1/2 MS+pH 5.8對叢生芽的增殖效果較好。NAA屬于生長素類，生長素對器官建成的作用最明顯的表現是在促進根原基形成及生長上，所以NAA在對根的誘導培養中具有促進生根作用。

參考文獻：

[1] 中國科學院昆明植物研究所.云南植物志第十四卷種子植物[M].北京：科學出版社，2003.

[2] 曹春林.中藥鑒定學[M].上海：上海科學技術出版社，1986.139.

[3] 謝宗萬.全國中草藥匯編上冊[M].第二版.北京：人民衛生出版社，1996.285-286.

[4] [明]李時珍，著.俞小平，黃志杰，譯.本草綱目精譯[M].北京：科學出版社，1992.

[5] 韋卡婭，劉燕琴，秦 靜，等.白及組培外植體的篩選研究[J].中國現代中藥，2008，5（10）：13-14.

[6] 郭巧生.藥用植物栽培學[M].北京.高等教育出版社，2006.

[7] 曾宋君，黃向力，陳之林，等.白及的無菌播種和組織培養研究[J].中藥材，2004，27（9）：625-627.

[8] 田英翠，袁雄強.白芨組織培養快繁技術研究[J].江蘇農業科學，2006（4）：75-77.

[9] 石云平，李 鋒，凌征柱.白芨組織培養與快速繁殖技術研究[J].南方農業學報，2009，40（11）：1408-1410.

[10] 余朝秀，李枝林，王玉英.野生白芨組培快繁技術研究[J].西南農業大學學報（自然科學版），2005，27（5）：601-604.

[11] 錢子剛.藥用植物組織培養[M].北京：中國中醫藥出版社，2007.

[12] 黃宗戴.植物組織培養及其在生物技術上的應用[M].北京：科學出版社，1983.162.

[13] 李合生.現代植物生理學[M].第二版.北京：高等教育出版社， 2006.

[14] 張建霞，付志惠，李洪林，等.白芨胚發育與種子萌發的關系[J].亞熱帶植物科學，2005，34（4）：32-35.

[15] 龍春林，程治英，王 俐，等.蘭州百合器官離體培養外植體位置效應觀察[J].云南植物研究，2004，26（2）：221-225.

[16] 肖尊安.植物生物技術[M].北京：化學工業出版社，2005.endprint