乙醇—硫酸銨雙水相提取魚腥草總黃酮

郝紅英+周芳+王改利+高陽逸+丁小娟

摘要：通過單因素試驗優化了影響乙醇-硫酸銨雙水相提取魚腥草（Herba houttuyniae）總黃酮提取率的因素，進一步通過正交試驗確定了各因素的影響程度，順序為乙醇濃度>提取溫度>提取時間>料液比。優化后的提取條件為脫脂魚腥草粉末2.0 g，乙醇用量32.50%（w）、硫酸銨16.00%（w）、料液比1∶15、提取溫度60 ℃、提取時間30 min，在該條件下，魚腥草總黃酮提取率為3.16%。

關鍵詞：魚腥草（Herba houttuyniae）；雙水相；總黃酮；提取工藝

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4844-03

魚腥草（Herba houttuyniae）為三白草科蕺菜屬多年生草本植物，其具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理作用，還可增強機體免疫功能[1，2]。魚腥草含有多種活性成分[3，4]，如揮發油、阿福豆甙、金絲桃甙及蕺菜堿，黃酮類成分有斛皮素、斛皮苷、綠原酸、金絲桃苷等。魚腥草活性成分的提取，尚無統一的方法，常見的提取方法[5]有水煎煮法、醇提取法、索式提取法及超聲波提取法等，但鮮見采用雙水相體系提取魚腥草黃酮的文獻報道。近年，雙水相萃取（Aqueous two-phase，ATP）技術因設備投資少，操作簡單，引起了人們極大的關注，并且被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領域[6]。基于與水互溶的有機溶劑和鹽水相的雙水相萃取體系具有價廉、低毒、較易揮發等特點。

本試驗應用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取魚腥草中主要成分總黃酮，以總黃酮提取率為指標，采用單因素試驗和正交試驗法，考察提取溶劑濃度、料液比、提取時間及提取溫度等對總黃酮提取工藝的影響，確定乙醇-硫酸銨雙水相體系提取魚腥草總黃酮的較佳工藝條件，旨在為魚腥草總黃酮提取工藝的產業化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁標準樣品（中國藥品生物制定檢定所， 生化試劑），其他試劑均為分析純；魚腥草（藥店所售中草藥）。

電熱恒溫水浴箱（北京市永光明醫療儀器廠）、SHZ-D（III）型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）、7230G型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 稱取魚腥草干細粉（過60目篩）于索氏提取器中，經石油醚脫脂，并除去部分色素。同時，稱取2.0 g脫脂后烘干的樣品于250 mL碘量瓶中，按一定的料液比加入乙醇-硫酸銨雙水相溶液，置于恒溫水浴箱中，提取一段時間后過濾，靜置分層，將濾液用分液漏斗將兩相分開，即得魚腥草黃酮類化合物提取液，將醇相提取液高速離心25 min后經微孔濾膜過濾，用甲醇定容至250 mL，以供分析測試用。

1.2.2 分析方法 魚腥草中黃酮類化合物含量的測定參照文獻[7，8]的方法，以蘆丁為標樣測定魚腥草黃酮類化合物的含量，所得標準曲線回歸方程為Y=0.093 8A+0.000 1，式中，Y為蘆丁質量濃度（g/mL），A為吸光度，相關系數R?=0.999 7。

取2.5 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中，加5%（w）的NaNO2 1 mL，搖勻，放置5 min后加入10%（w）的Al（NO3）3 1 mL，5 min后再加入4%（w）的NaOH 10 mL，搖勻，用去離子水稀釋至刻度，10 min后于7230G型分光光度計上在510 nm處測定吸光度A（以試劑為空白參比），根據蘆丁標準曲線回歸方程，得到提取液濃度，總黃酮提取率按照下式計算：

Et=（C×V×D）/W×100%

式中，Et為總黃酮提取率，C為測得的提取液濃度，V為提取液醇相體積，D為稀釋倍數，W為原料的質量。

1.2.3 正交試驗 在單因素考察的基礎上，采用L9（34）正交表進行了正交試驗（表1）。

2 結果與分析

2.1 乙醇溶液濃度對魚腥草總黃酮提取效果的影響

在溫度為40 ℃，固定硫酸銨用量6.4 g（16.00%），脫脂魚腥草粉末2.0 g，料液比1∶20，提取時間30 min的條件下，考察了乙醇溶液濃度對魚腥草總黃酮提取率的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，在硫酸銨用量一定的情況下，隨著乙醇溶液濃度的增加，總黃酮提取率逐漸增加，當乙醇溶液濃度達到32.50%時，提取率達到最大。此后，隨著乙醇溶液濃度的增加，總黃酮提取率顯著下降。其主要原因可能是，乙醇溶液濃度過低不利于黃酮的浸出，隨著乙醇濃度增加，雙水相體系的分相能力增加，乙醇在上層的體積也逐漸增加，黃酮溶解度增加，一些脂溶性有機物的溶出量也會增加，抑制了總黃酮的浸出。因此，確定合適的乙醇溶液濃度為32.50%。

2.2 料液比對魚腥草總黃酮提取效果的影響

在溫度為40 ℃，硫酸銨用量16.00%，乙醇溶液濃度為32.50%（r=0.667），提取時間30 min的條件下，考察了料液比對魚腥草總黃酮提取率的影響，結果如圖2所示。由圖2可知，在硫酸銨和乙醇用量比例一定的情況下，隨著料液比的增加，總黃酮的提取率逐漸增加，當料液比為1∶20時，提取率達到最大。此后，隨著料液比的增加，總黃酮提取率開始降低。原因可能是，料液比較小時，溶劑滲透并擴散到細胞內的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴散的速度小，如果料液比較大時，雖然有利于溶劑進入細胞內破壞疏水鍵，利于黃酮化合物向溶劑中擴散，但會耗費大量的溶劑和硫酸銨。因此，確定合適的料液比為 1∶20較好。

2.3 提取時間對魚腥草總黃酮提取效果的影響

在溫度為40 ℃，硫酸銨用量16.00%，乙醇溶液濃度為32.50%（r=0.667），料液比1∶20的條件下，考察了提取時間對魚腥草總黃酮提取率的影響，結果如圖3所示。由圖3可以看出，魚腥草總黃酮提取率在20～50 min時隨著提取時間的延長而升高，當提取時間為50 min時，提取率達到最大，繼續延長提取時間總黃酮提取率反而下降，原因可能是，在提取初期，魚腥草中的總黃酮不斷浸出，隨著提取時間的延長，總黃酮的浸出率逐漸達到最大。如果繼續延長，乙醇揮發量增加，會引起黃酮提取率降低。因此，確定合適的提取時間為50 min。endprint