正交設計優化檸檬酸提取藍莓花青素工藝

陳海龍+高曉輝+翟丹云+趙莉莉+李赟+楊曉麗+董延虎

摘要：以藍莓為原料，藍莓花青素含量為指標，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗設計法優化檸檬酸提取藍莓花青素的工藝。驗證試驗確定了檸檬酸提取藍莓花青素最佳提取工藝，即檸檬酸濃度為30%，料液比（g/mL）為1∶15，提取溫度為50 ℃，提取時間為90 min。在最優工藝下花青素含量為3.62 mg/g。

關鍵詞：藍莓；花青素；檸檬酸；正交試驗法

中圖分類號：TQ914 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4859-04

藍莓為杜鵑花科多年生灌木，其果實呈深藍色，被白霜，含有豐富的花青素和維生素等活性成分[1]。花青素與糖以糖苷鍵結合而形成花青素，作為一種天然色素分布廣泛，存在于許多水果中，如紫薯、葡萄、桑甚、藍莓等。研究發現，經常食用花青素可明顯改善視力、減緩老年斑的沉積、促進心肺等功能[2，3]，且能延緩皮膚衰老，有效預防感染性疾病和降低早期奧本海默癥狀的患病風險，對由糖尿病引起諸多疾病有輔助治療作用[4，5]。因為花青素具有明顯的保健功效，使得富含花青素的原料被作為營養加強劑添加到食品中[6，7]。藍莓富含花青素，可作為藥食兩用水果進一步開發成具有降血脂的保健食品和藥品[8]。提取藍莓中的花青素主要使用鹽酸酸化的醇類，而花青素多用于食品，檸檬酸既是食品添加劑又是藥物工業原料。鑒于鮮見到檸檬酸提取藍莓花青素的相關報道，本試驗以藍莓為原料，研究檸檬酸濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素對藍莓花青素中主要成分矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）[9]含量的影響，運用正交試驗法優化檸檬酸提取藍莓花青素的工藝，旨在為開發藍莓花青素功能性食品藥品提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

藍莓購自蘭州市場，按1∶5比例加水打漿冷藏備用；純水自制；檸檬酸（上海化學試劑廠），批號830905；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）（ChromaDex公司），純度96.4%，批號528-58-5。

XS225A型電子分析天平普利塞斯，瑞士；優普UPT-I-20L落地式純水機四川優普超純科技；UV2300Ⅱ型雙光束紫外可見光光度計（上海天美科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藍莓花青素的提取工藝 準確稱取打漿藍莓5.000 g，加入一定體積的檸檬酸溶液，在一定溫度下加熱，振蕩，抽濾、定容[10]。

1.2.2 花青素含量的測定 通過紫外分光光度計測定，以C3G作為對照品，采用標準曲線計算法計算，花青素含量以C3G計[11，12]。

花青素含量=（n×v×f）/M，其中，n為樣品濃度， v為樣品體積，f為稀釋倍數，M為藍莓漿質量。

1.2.3 單因素試驗 固定檸檬酸濃度（質量分數）30%，藍莓果漿與檸檬酸溶液料液比1∶10（g/mL）、溫度30 ℃、提取60 min的情況下，改變另外的因素水平，檸檬酸濃度（g/mL）為10%、20%、30%、40%、50%；料液比（g/mL）為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；溫度為30、40、50、60、70 ℃；提取時間為30、60、90、120、150 min；進行單因素試驗，以C3G吸光度為指標，擇優參數。

1.2.4 正交試驗設計 采用SPSS 19.0軟件，在單因素試驗基礎上，依據單因素試驗結果設置水平，以檸檬酸濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素的3個水平設計正交試驗L9（34）優化檸檬酸提取藍莓花青素工藝。

1.2.6 藍莓中花青素含量測定 標準品溶液配制：準確稱取C3G標準品（純度96.4%）0.005 06 g，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇，制成含C3G 0.975 6 mg/mL的儲備液溶液。

樣品溶液配制：準確吸取按照“1.2.1”制備的樣品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇，待測。

1.2.7 數據處理方法 采用SPSS 19.0統計軟件，分析試驗數據，結果以平均值±標準誤差表示，對各組結果采用Duncans法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 花青素含量測定

2.1.1 檢測波長的選擇 取C3G標準品溶液，進行紫外全波長掃描。由圖1可知，C3G在可見光區域520 nm處有最大吸收，可見光區域520 nm處為其特征吸收，所以本試驗在520 nm波長處檢測C3G的含量。

2.1.2 線性關系考察 分別取標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，進行紫外分光測定。以吸光度（y）對C3G的質量濃度（x）（mg/mL）進行線性回歸。結果（圖2）顯示，C3G在0～0.08 mg范圍內與吸光度相關性較好，回歸方程為y=22.161x+0.006 4，R2=0.998 8。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 檸檬酸濃度對藍莓花青素吸光度的影響 結果（圖3）顯示，其他條件不變時，藍莓花青素的吸光度隨檸檬酸濃度的增加而增加。當檸檬酸濃度達30%時，吸光度最大，與其他濃度相比，差異顯著，這是因為花青素在酸性條件下呈穩定的紅色。檸檬酸濃度較小時，pH較高，花青素不溶于溶液；當檸檬酸濃度過大，花青素吸光度有所降低，由于酸性較強引起花青素水解，導致含量下降[13，14]。考慮其穩定性，防止花青素水解。因此選擇檸檬酸濃度20%～40%為正交試驗因素水平。

2.2.2 料液比對藍莓花青素吸光度的影響 由圖4可知，藍莓花青素吸光度隨著料液比的提高呈增加趨勢。當料液比>1∶5時，藍莓花青素吸光度大幅提高，說明花青素向提取液擴散速率變快，充分溶解，溶解量增大。而料液比繼續增加，花青素吸光度變化不大，料液比超過1∶10吸光度基本不變，說明花青素溶解速率達到平衡，因此料液比選擇1∶10～1∶20為正交試驗因素水平。endprint

2.2.3 提取溫度對藍莓花青素吸光度的影響 由圖5可知，藍莓花青素吸光度隨著提取溫度的增長呈上升趨勢。溫度升至40 ℃時，粗提液中藍莓花青素吸光度最高。隨著溫度進一步升高，藍莓花青素吸光度開始下降，超過50 ℃吸光度顯著下降。產生這種現象的原因可能是溫度低，花青素溶出不完全，導致含量較低，然而花青素是熱敏性色素，在高溫下不穩定，結構容易發生改變[15]，所以升高到一定溫度，部分花青素發生分解，使得花青素吸光度降低。因此選擇30～50 ℃為正交試驗因素水平。

2.2.4 提取時間對藍莓花青素含量的影響 由圖6可知，隨著提取時間的延長，藍莓花青素吸光度呈上升趨勢，在30～90 min內花青素增加較快，超過120 min花青素含量不再上升，說明120 min左右花青素提取達到平臺期。隨著提取時間的增加，花青素被分解，吸光度略有下降。因此，試驗選擇60～120 min為正交試驗因素水平。

2.3 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇4個影響因素的3個水平設計正交試驗L9（34）優化檸檬酸提取藍莓花青素工藝，考察指標為花青素含量，正交試驗結果見表2，正交試驗最優工藝為A2B2C3D1。

方差分析結果見表3。由表3可知，檸檬酸提取藍莓花青素的影響因素中檸檬酸濃度的影響極顯著，提取溫度、料液比和提取時間次之，影響不顯著。極差分析結果中得出的最佳工藝是A2B2C3D2，即檸檬酸濃度為30%，料液比為1∶15，提取溫度為50 ℃，提取時間為90 min。

2.4 驗證試驗

由于極差分析最優工藝與正交試驗結果最優工藝不一致，正交試驗最優工藝為A2B2C3D1，而極差分得出的最佳工藝是A2B2C3D2，所以需進行驗證試驗。以上述兩組最佳工藝條件進行驗證試驗。結果表明，極差分析最優工藝下提取液花青素含量為3.62 mg/g， RSD=1.08%（n=6），正交試驗最優工藝下提取液花青素平均含量為3.57 mg/g，RSD=0.58%（n=6）。根據提取率選擇極差分析的最優工藝A2B2C3D2。

3 小結

在單因素試驗基礎上，運用正交試驗法優化了檸檬酸提取藍莓花青素的工藝條件。在正交試驗設計所選條件范圍內，檸檬酸濃度對藍莓花青素含量的影響最大，其次為提取溫度，然后是提取時間，料液比影響最小。驗證試驗確定檸檬酸提取花青素的最佳工藝參數為檸檬酸濃度為30%，料液比為1∶15 g/mL，提取溫度為50 ℃，提取時間為90 min。最優工藝下花青素含量為3.62 mg/g。

花青素作為一種天然水溶性食用色素，不僅色澤鮮艷、安全、無毒，而且還具有良好的營養和保健功效，在食品、化妝品、醫藥等方面已顯示出巨大的應用潛力[16]。藍莓作為花青素含量最豐富的資源之一，研究其提取分離和開發利用具有重要的意義。隨著人們生活水平的提高。對天然產品的需求量越來越大。天然的花青素主要作為食品藥品中間體，提取多采用鹽酸酸化的醇類、冰乙酸等溶劑提取[15，17]。冰乙酸氣味刺激性較大，對食品口感影響較大。檸檬酸作為食品添加劑無色無味，對后期花青素的應用影響較小，本試驗采用檸檬酸作為新的提取溶劑，旨在為藍莓花青素資源的開發和利用提供新方法。

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