產N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌構建、發酵及應用研究進展

秦志杰，岳秋林*，劉新利

（齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東 濟南 250353）

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyleneglucosamine，GlcNAc）是一種氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的衍生物，是生物體內多種多糖的基本組成單位，也是合成雙歧因子的重要前體，易溶于水，具有還原性，在生物體內具有重要的生理功能。GlcNAc廣泛存在于自然界中，于動物體、植物體、細菌和真菌中均有存在，是幾丁質和殼聚糖的主要成分[1-3]。GlcNAc主要應用于食品保健、醫藥、化妝品等領域，需求量大，市場廣闊。作為膳食補充劑，GlcNAc具有保護軟骨組織及骨關節作用；作為藥品，GlcNAc在治療炎癥性腸病方面表現出明顯功效。同樣因其能夠提高內質網蛋白內穩態的作用，可起到延長細胞壽命的作用[4]。在歐美等發達國家，GlcNAc己經作為膳食補充劑而被廣泛應用[5]。GlcNAc的傳統生產方法主要采取甲殼素水解法，該方法在原料供應、環境保護及產品安全方面存在許多潛在問題[3，6]，首先，以蝦、蟹殼中的甲殼素作為原料，隨著GlcNAc市場需求的日益增加，原料供給可能出現短缺，導致GlcNAc市場供應不足；其次，如今甲殼素水解法采用酸水解，GlcNAc生產過程中產生大量廢水，嚴重污染環境；最后，來源于蝦、蟹殼的GlcNAc可能使對海產品過敏的人群產生過敏反應[7]。因此，食品安全級的、非甲殼類動物來源的GlcNAc是目前消費者需求的產品。微生物發酵法不受原料來源的季節和地域限制，生產效率高，污染小，而且不會產生過敏反應。因此，微生物發酵法具有可持續性的重大社會經濟效益，構建高效生產GlcNAc的基因工程菌，采用微生物發酵法生產GlcNAc可有效解決其傳統生產方法所帶來的諸多問題[8]。現如今國內外研究較深入的生產GlcNAc的基因工程菌主要為大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。在這些工程菌的構建中，基礎的思路都是過表達GlcNAc合成途徑的關鍵酶基因，敲除降解途徑的關鍵酶基因以及主要副產物的合成酶基因。近些年，隨著代謝工程的不斷發展，支架介導途徑、模塊化工程、動態調控、代謝組學分析等方法逐漸應用于工程菌的構建中以提高GlcNAc的產量，高效生產GlcNAc的基因工程菌的構建及發酵在工業化生產中表現出了巨大的潛力和吸引力。

隨著GlcNAc市場需求的日益增加，存在諸多潛在問題的傳統生產方法所生產的GlcNAc在產量及品質上漸漸不能滿足人們的需求，構建高產GlcNAc的工程菌給人們指出了新方向，并顯示出了巨大潛力。本文主要從產GlcNAc的工程菌的構建與GlcNAc應用現狀方面進行了整理綜述，并展望了其重點的研究方向，以期為GlcNAc的發酵生產及廣泛應用提供支持。

1 GlcNAc工程菌的構建及發酵

1.1 大腸桿菌產N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的構建及發酵

大腸桿菌因易于培養、生長周期短、遺傳背景清晰、遺傳操作技術簡便成熟等優點被廣泛應用于代謝工程的改造，并被用于發酵生產許多有經濟價值的化合物[9]。

2005年DENG M D等[10]使用一系列代謝工程策略構建了一株產GlcN和GlcNAc的高性能的重組大腸桿菌菌株。首先，使用易錯聚合酶鏈式反應（error-pronepolymerasechain reaction，epPCR）進行氨基葡萄糖合成酶（glucosamine synthase，GlmS）的定向進化，并獲得了解除產物抑制的GlmS，并證明過表達突變體GlmS可有效增加GlcN產量，使GlcN質量濃度達到了75 mg/L水平。然后，T7lac-ScGNA1的表達盒被整合在manXYZ基因座上，整個nagBACD操縱子和乙酰氨糖轉運基因nagE的一部分被替換為四環素抗性基因tetR，使GlcN產量達到了17 g/L。最后，為了避免GlcN的快速降解并緩和GlcN及其降解產物對宿主細胞的抑制作用，過表達了異源的GlcN-6-磷酸（phosphate，P）乙酰轉移酶基因（GNA1）以延伸途徑至GlcNAc，因為GlcNAc是一種在大腸桿菌宿主內穩定和惰性的氨基糖。最終以葡萄糖為合成GlcNAc的底物，在1 L罐的流加方式下，經過誘導和條件優化后，于發酵72 h時，構建好的菌株GlcNAc產量達到了110 g/L。DENG M D等的工作解除了GlcN-6-P對氨基葡萄糖合成酶的抑制以及氨基葡萄糖和它的降解產物對宿主細胞的抑制效應，并且進一步阻斷了GlcN和GlcNAc向胞內的轉運進而阻止其作為碳、氮源的胞內降解利用，為后續生產GlcNAc基因工程菌的構建提供了基礎思路和方向指導。

除了在在宿主菌中對其合成途徑和轉運途徑進行基因工程改造外，宿主菌的培養條件對提高乙酰氨基葡萄糖產量也十分重要。2012年，陳欣等[11]通過過表達氨基葡萄糖（GlcN）合成酶基因和GlcN-6-P乙酰轉移酶基因構建了有效生產GlcN和GlcNAc的重組大腸桿菌。并運用Red同源重組技術敲除其轉運子編碼基因nagE與manX，培養雙基因敲除菌株至10 h時，GlcN產量達到了最大值4.82 g/L，同時GlcNAc產量達到了最大值118.78 g/L，分別是對照菌株的1.2倍和2.86倍。該結果表明，轉運子編碼基因nagE與manX的敲除可顯著降低胞外的GlcN與GlcNAc向胞內轉運，從而提高GlcN與GlcNAc在發酵液中的積累量。并對恒速補料、間歇補料和指數補料這3種不同的葡萄糖補料策略對GlcN和GlcNAc產量的影響進行了研究，以進一步增強GlcN和GlcNAc生產。該研究構建了有效生產GlcN和GlcNAc的重組大腸桿菌，通過使用重組菌E.coli-glmS-GNA1研究了葡萄糖補料策略（恒速補料、間歇補料和指數補料）及溶氧水平對GlcN和GlcNAc生產的影響，并開發了多級葡萄糖供應策略。而且其開發的時間依賴的葡萄糖補料方法可能對重組大腸桿菌生產其他精細化學品同樣適用。

1.2 枯草芽孢桿菌產N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的構建及發酵

大腸桿菌工程菌相對于傳統甲殼素水解法表現出了巨大優勢及應用潛力，然而，E.coli作為工業化生產宿主存在以下不足：首先，因為E.coli不是食品安全級菌株，使得E.coli來源的GlcNAc應用領域有限。其次，E.coli易在發酵過程中受噬菌體污染，在工業規模發酵生產中不適用。因此，適合于工業規模發酵生產的食品安全級菌株是微生物發酵法生產GlcNAc的理想菌株。許多通常被認為安全的微生物菌株（generally regarded as safe，GRAS）已被鑒定，并被開發用于營養保健品的合成，而且已經利用這些菌株實現了許多重要營養制品的生產[12]。枯草芽孢桿菌發酵工藝成熟、遺傳背景清晰、基因操作技術成熟并且不易受噬菌體污染，被廣泛應用于發酵工業以生產透明質酸（hyaluronic acid，HA）、核黃素等各種化合物，B.subtilis是一種重要的食品安全級工業生產菌株[13-15]。因此，B.subtilis是生產GlcNAc的理想宿主。

劉延峰等[16]構建了重組枯草芽孢桿菌菌株以提高GlcNAc生產。使用基因工程，將基因GlmS和Gna1共同過表達以增強GlcNAc的合成，同時敲除基因nagP、nagA、gamA和nagB以阻止GlcNAc的降解。在3 L補料分批生物反應器中獲得了5.19g/L的GlcNAc產量[17]。然后通過基于脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）引導的支架系統的空間調控控制關鍵酶Gan1和GlmS的比例為2∶1，增強了關鍵途徑中氨基葡萄糖合成酶與GlcN-6-P乙酰轉移酶的酶活。通過基因spo0A和sigE的敲除阻斷了孢子形成。此外，通過呼吸鏈工程敲除了編碼細胞色素的基因以減少維持新陳代謝的需求。這些方法將GlcNAc的產量提高到了20.58g/L[18]。為了進一步提高GlcNAc產量，將GlcNAc合成相關的代謝網絡中的糖酵解途徑、肽聚糖合成途徑以及N-乙酰氨基葡萄糖合成途徑三個模塊，通過模塊化工程進行了優化組裝。最終改造后的枯草芽孢桿菌在3 L發酵罐進行補料分批發酵，葡萄糖初始含量為20 g/L。通過這種補料分批發酵方式，GlcNAc產量達到了31.65 g/L[19]。

朱妍荻[20]以一株可合成GlcNAc的重組枯草芽孢桿菌為出發菌株，通過單敲除prophage1、prophage3、skin、PBSX和pks五個區域的非必需基因組片段，進一步提高細胞代謝效率和GlcNAc合成效率，并在此基礎上，對重組枯草芽孢桿菌合成GlcNAc的發酵條件進行了優化，將葡萄糖含量控制在5g/L進行溶氧分階段調控（0～7h，30%；7～15h，50%；15～50 h，40%；50～72 h，30%）。在此條件下，GlcNAc產量提高到了35.77g/L，顯著提高了GlcNAc的產量和生產強度。

1.3 其他生產N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的構建及發酵

在其他食品安全菌株中，很多研究者同樣做出了構建生產N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的嘗試并取得了一定進展。

王雅婷等[5]嘗試構建了一株新的基因工程菌谷氨酸棒狀桿菌來生產GlcNAc。通過增強GlcNAc的合成途徑，并敲掉GlcNAc的消耗代謝途徑及主要副產物合成途徑，使得構建的工程菌glmS-gnal-C.g-△nagAB在250 mL搖瓶發酵體系中GlcNAc產量達到1.43 g/L左右；隨后將合成副產物乳酸的乳酸脫氨酶基因ldh敲掉，使得glmS-gnal-C.g-△nagAB△ldh生產GlcNAc能力達到2.23 g/L，副產物乳酸濃度幾乎為0；實驗結果證明了構建谷氨酸棒狀桿菌工程菌生產GlcNAc的可行性。

LEE S W等[21]通過過表達無變構調節的Gfa1p突變體和像鹵代酸脫鹵素酶的磷酸酶YqaB證明了GlcNAc在釀酒酵母中的生產，并進一步降低糖酵解通量提高了GlcNAc產量。并發現真核磷酸果糖激酶1被果糖2,6-二磷酸變構激活。合成F26BP的PFK-2的破壞，導致GlcNAc產量的輕度降低并且葡萄糖消耗量和乙醇產量沒有顯著變化。但是，當使用半乳糖作為無PFK-2菌株的唯一碳源時，GlcNAc產量明顯增加并且乙醇產量減少，這表明可以使糖酵解通量進一步降低以提高GlcNAc產量。

2 GlcNAc應用現狀

GlcNAc屬于氨基糖的一個大類，具有許多功能，如除了用作營養補充劑外，GlcN還被用于食品和運動飲料以生產用于關節健康的功能性食品，并用于化妝品中改善皮膚水分[22]。GlcNAc及其類似物（如幾丁質和殼聚糖），可作為生物的碳或氮源。實際上，它們也可以用作生物質，已有研究顯示粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）能夠將GlcNAc轉化為生物燃料。GlcNAc也是糖蛋白，蛋白多糖，粘多糖和其他結締組織構件的組分，而粘多糖和糖蛋白是組織修復和抗炎反應的底物材料，于是人們發現GlcNAc也是治療多種疾病的十分有價值的藥劑[23]。

2.1 GlcNAc在食品領域的應用

GlcNAc溶解后可明顯抑制一些細菌和真菌的生長且具有一定成膜性，將其涂于果蔬表面形成薄膜，可以抑制果蔬失水速率及其呼吸強度，減緩營養物質的消耗，同時具有抑制微生物的侵染，減緩果蔬的腐爛，增加保藏時間的功能，從而達到保鮮目的[24]。因此GlcNAc可作為一種天然的抗菌劑和保鮮劑在食品保藏中發揮作用。GlcNAc還可與肉類食品在加熱處理時從肉的血紅蛋白中釋放的鐵離子形成螯合物，從而抑制鐵離子的催化活性，起到抗氧化的作用，進而解決肉類食品中因含有高度易被氧化的不飽和脂肪酸，而使肉類食品容易腐敗變質的問題。果汁中含有大量帶負電荷的纖維素、果膠、多聚戊糖等物質，在存放期間很容易使果汁變渾濁。當上述負電荷物質和具有正電荷的GlcNAc吸附絮凝后，再經處理后的澄清果汁是一個穩定的熱力學體系，所以能長期存放，不產生渾濁，因而GlcNAc亦可用作果汁、酒類等的澄清劑[25]。因為GlcNAc熱量低、保健機能好，且被食用后血糖不會升高，可以作為糖尿病人和肥胖者的理想甜味劑；GlcNAc能夠促進乳酸菌及雙岐桿菌的生長，因此可將其添加到乳制品中，促進菌體生長繁殖；GlcNAc制成保健品可以減少人體腸道內有害菌群，增加有益菌群，調節菌群的分布，從而調整腸道內的微生態環境[26]。

2.2 GlcNAc在醫療方面的應用

關節軟骨的基質為蛋白聚糖、軟骨細胞和膠原蛋白，它可緩沖來自機械力的沖擊，并提供一個光滑的骨表面，使骨頭之間可以很容易滑過而不摩擦損傷。缺乏蛋白多糖前體和滑液會導致骨骼關節的結構和功能缺陷并發生骨關節炎。發病率隨著年齡增長而增加，多發于65歲以上人群[23]。GlcNAc是軟骨組織及關節液等的關鍵組成物質，GlcNAc能夠再生并修復軟骨組織，且能防止軟骨組織遭受損傷，具有重要的藥用效果。臨床實驗結果表明，GlcNAc不僅具有改善骨關節炎的作用，同時還有控制病情的作用[27]。GlcNAc也可以誘導白血病細胞的分化，很可能成為新的低毒、高效治療白血病的候選藥物[28]。另有研究表明，在白酒中加入GlcNAc后，肝組織及腸黏膜組織的損傷均有不同程度緩解，推測GlcNAc減輕乙醇對肝臟的損傷可能與GlcNAc恢復腸黏膜上皮細胞功能、穩定腸道黏膜屏障功能、抑制腸內細菌穿透腸上皮進入血液循環及內毒素入血有關。因此，GlcNAc可以緩解酒精對肝臟與腸道的損傷與破壞，對機體起到保護作用[29]。有學者發現，GlcNAc可以激活鈣信號通路，誘導T細胞增殖，從而使T細胞在細胞免疫的過程中活化并特異性的攻擊帶有相應抗原的腫瘤細胞，從而實現抗腫瘤的目的[5]。GlcNAc的抗菌、調節機體免疫、抑制腫瘤細胞生長等特性，使其在醫療領域表現出巨大的市場潛力[30]。

2.3 GlcNAc在化妝品方面的應用

人體皮膚含有角質層和真皮層，用以保護身體免受干燥和紫外線照射等惡劣的環境條件損傷。角質層在維持皮膚的水分和緊致方面起著關鍵作用。它由扁平化的死細胞、角質細胞以及脂質基質和天然水分因子的復合物組成。真皮是皮膚的內層，由成纖維細胞產生的膠原蛋白、彈性蛋白和粘多糖組成[23]。膠原蛋白是健康肌膚保持彈性，強度，光滑度和豐滿外觀的原因。粘多糖（如透明質酸和蛋白聚糖）具有高保水能力，并且是保持皮膚水分的重要組分。透明質酸主要由成纖維細胞和角質形成細胞產生，是一種眾所周知的能將角質層和真皮水分保留的成分[23]。GlcNAc可以促進人體內蛋白聚糖的代謝合成，并提高在人體肌膚中透明質酸的含量，透明質酸吸收水分后，使得彈力纖維及膠原蛋白處在充分濕潤的環境中，從而維持細胞外基質的彈性，因此GlcNAc具有延緩肌膚衰老的功效，被添加在許多化妝品中以起到加強保濕的功效[20]。另外，BISSETT D L等[31]研究發現，口服天然GlcNAc能加強透明質酸在體內的合成，改善皮膚水潤程度。國內有學者發現，GlcNAc能夠抑制細胞內黑色素的形成，具有開發美白化妝品的潛力[32]。

3 結論與展望

目前構建的大腸桿菌工程菌雖然得到了較高產量的GlcNAc，但因大腸桿菌并非食品安全菌株，使其工業化生產受到限制。枯草芽孢桿菌作為遺傳背景清晰、發酵工藝成熟、基因操作技術成熟并且不易受噬菌體污染的常用工業菌株，是生產GlcNAc的更好選擇，但其目前產量不高，谷氨酸棒狀桿菌工程菌及釀酒酵母工程菌面臨著同樣的問題。利用動態調控元件、代謝組學、動力學分析等手段進一步確定GlcNAc合成途徑中的限速步驟并解除無效循環以提升枯草芽孢桿菌生產GlcNAc的能力仍然需要大量的研究。同時，溶氧水平等發酵條件的優化同樣對提高GlcNAc產量具有重要意義。

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