基于高通量定量PCR研究城市化小流域微生物污染特征

莊芳芳，蘇建強，陳輝煌，朱永官

1. 中國科學院城市環境研究所城市環境與健康重點實驗室，廈門 361021 2. 中國科學院大學，北京 100049

水體環境與人類生產生活息息相關，隨著社會經濟地快速發展，水體微生物污染日趨加劇，成為全球性環境問題，我國各大水系均受到不同程度的病原微生物污染。此外，國外40%的河流及河口由于病原微生物污染，水質難以達到水環境質量標準[1]。然而在水質安全監測方面，目前我國《地表水環境質量標準(GB3838—2002)》僅把糞大腸菌群濃度規定為唯一的微生物指標[2]。水體微生物污染(包括致病菌、病毒、寄生蟲)會引起多種傳染病和寄生蟲病，對水質安全和人體健康造成重要威脅[3]，僅用糞大腸菌群作為唯一指標無法準確評估水體微生物污染。

糞便污染是水體微生物污染的主要來源之一[4]，其中的病原微生物可經飲食、呼吸道、皮膚接觸等途徑感染人類，引起胃腸道疾病和呼吸道系統等疾病。由于腸道微生物差異,不同宿主來源糞便對水質污染有著不同程度的危害，鑒別水體的糞便污染來源及污染程度有助于水體微生物污染來源監管，從而保障水質安全。傳統的糞大腸菌群等糞便污染指示微生物由于能夠在自然環境中存活并繁殖，在各種動物的腸道中沒有特異性等缺陷不能分辨糞便污染來源，無法準確評估水體微生物污染狀況[5-6]。微生物源示蹤技術的出現解決了這一難題，微生物源示蹤技術(Microbial Source Tracking，MST)自20世紀90年代被提出[7-8]，是基于不同宿主腸道微生物的差異，利用宿主特異性或與宿主相關的微生物指標建立鑒別糞便污染源的方法[9]。利用TaqMan探針熒光定量PCR(quantitative PCR, qPCR)方法進行溯源準確度高、特異性強，可同時進行定性和定量檢測，是近年來較為成熟與廣泛應用的方法[10-11]。

微生物源示蹤技術僅可用于鑒別糞便污染的來源，不能指示各種病原微生物的含量，且MST指示微生物與病原微生物之間的相關關系尚存在質疑。因此，評估水體環境病原微生物污染仍需對病原微生物種類及含量進行測定。培養法與分子生物學方法是目前主要的病原微生物檢測手段[12]，但由于水體環境中病原微生物含量往往較低，培養法費時、昂貴且無法對含量進行定量[13-14]；隨著分子生物學的發展，qPCR方法更為靈敏、方便、快速，在環境領域逐漸得到了應用[15]。

后溪是廈門市第二大河流，干流全長29.25公里，總面積209.3平方公里，發源于戴云山脈和博平嶺山脈交界的老寮蒼山西麓，自西北向東南流經集美區大部，經后溪水閘后匯入杏林灣[16]。后溪流域是廈門市和集美區重要的水源涵養區和生態敏感區，其上游石兜、坂頭兩大水庫是廈門市城市飲用水重要供給地；中下游兩岸是快速發展的城鎮區域，城區河流極易受到居民生活污染；下游為入?？?，其上游的污染很可能造成入?？诤徒逗０稁廴尽Ｑ芯吭摿饔蛭⑸镂廴緺顩r對保護流域水環境、水質安全管理及人類健康具有重要意義。

本研究利用基于TaqMan探針的高通量qPCR檢測技術，對廈門市后溪流域冬季微生物污染狀況進行研究，包括常見糞便污染源(人類、反芻動物、家禽、豬、狗)微生物源示蹤和病原微生物(胃腸道、肺炎、角膜炎相關疾病病原微生物)檢測，旨在探明該流域水體微生物污染特征和污染來源。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 研究區域概況及樣品采集

水樣采集于2017年1月，采樣點分布于整條流域，采樣位置包括上游源頭H1斷面、水庫H2～H5斷面、水庫下游H6斷面、居民生活產業區H7、H8斷面及集美新城區H9、H10斷面，共計10個斷面，分布見圖1。所有采樣位置均用GPS 定位儀精確定位，位點信息見表1。使用無菌聚乙烯塑料采樣瓶采集2.5 L水樣，6 h內送回實驗室分析。

圖1 研究區域及采樣點位置Fig. 1 Schematic map of the studied area and sampling sites

1.2 理化性質測定

各采樣點pH、濁度、溶解氧的測定采用多參數水質分析儀(Hydrolab DS5，美國)分析?？偺?、總有機碳、總氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮、總磷、磷酸鹽根據以前研究中使用的方法進行測定[17]。

1.3 高通量qPCR檢測方法

1.3.1 樣品預處理與DNA提取

水樣采用0.2 μm的硝酸纖維濾膜，按照水質狀況選擇過濾體積，將過濾后的濾膜剪碎并使用FastDNA?土壤DNA試劑盒(MP Biomedical，美國)提取基因組DNA，使用NanoDrop ND-1000分光光度計(Nanodrop，美國)對提取的DNA質量和濃度進行檢測。

1.3.2 分子標記物

所采用的24個qPCR分子標記物包含1個細菌通用16S rRNA基因分子標記物、10個MST分子標記物(表2)及13個病原微生物分子標記物(表3)。引物、探針合成于Thermo Fisher公司(中國)。

表1 采樣位點信息Table 1 Characteristics of the sampling sites

表2 糞便污染分子標記物序列信息Table 2 Oligonucleotide sequences of MST markers for fecal pollution

表3 病原微生物分子標記物序列信息Table 3 Oligonucleotide sequences for pathogen markers

續表3

表4 采樣點理化性質Table 4 Physical and chemical properties of the sampling sites

分子標記物中TaqMan探針進行優化調整：將5’端熒光報告基團統一為羧基熒光素(6-carboxy-fluorescein，FAM)，3’端熒光淬滅基團用黑洞淬滅基團1(Black Hole Quencher 1，BHQ1)取代羧基四甲基羅丹明(Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)，3’端淬滅基團統一為BHQ1或小溝結合物-非熒光淬滅基團(Minor groove binder-non fluorescent quencher，MGB-NFQ)。這是由于TAMRA為熒光染料，在淬滅報告基團的同時會發射熒光；而BHQ1為非熒光染料，淬滅報告基團時自身不發射熒光，探針熒光本底低，使檢測靈敏度更高。對于MGB-NFQ淬滅基團，MGB可將探針的Tm值提高10 ℃左右，探針長度較短，使得探針淬滅基團與報告基團空間位置更近，且NFQ是非熒光淬滅基團，對報告基團熒光淬滅效果更佳。

本試驗24對分子標記物均使用美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) BLASTn工具進行比對，驗證探針和引物的特異性，比對后修改了其中的艱難梭菌(Clostridiumdifficile)cdtA分子標記物(表3)。

1.3.3 標準曲線質粒樣品的制備

采用標準質粒外標法對16S rRNA基因豐度進行絕對定量，采用大腸桿菌DNA為模板，將PCR擴增目的片段切膠回收、純化(Tiangen，北京)，與PMD19-T載體(Takara，日本)進行AT連接、轉化，挑取單菌落測序，序列經過BLAST比對后確認為16S rRNA基因片段，采用TIANprep MINI plasmid試劑盒(Tiangen，北京)提取得到的含有16S rRNA基因的質粒以10倍梯度稀釋至拷貝數范圍為109～103copies·μL-1，用于制作標準曲線。

1.3.4 高通量qPCR檢測

采用美國Wafergen公司SmartChip多樣品納升分配器分別將樣品(包括水樣DNA、質粒和無核酸酶滅菌水陰性對照，一個樣品3個技術重復)和引物、探針在SmartChip納升芯片(Wafergen，美國)上進行分配，隨后將芯片置于SmartChipCycler儀器(Wafergen，美國)上進行高通量qPCR[33-34]。

高通量qPCR反應體系為100 nL，包含1×TaqMan?Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems，美國)、1×ROX 參比染料(Invitrogen，美國)、1 mg·mL-1牛血清白蛋白溶液(Sigma，德國)、0.9 μmol·L-1正向引物與反向引物、0.25 μmol·L-1探針、5 ng·μL-1DNA和無核酸酶滅菌水。擴增程序為：50 ℃ 2 min激活尿嘧啶-N-糖基化酶，95 ℃ 10 min激活AmpliTaq Gold DNA聚合酶，40個循環(95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火和延伸)。程序完成后，軟件將自動分析并導出數據。

1.4 數據統計分析

1.4.1 數據統計

導出的數據按以下標準進行篩選：1)擴增效率需在80%～120%之間；2)循環臨界值(Cycle Threshold，CT)必須小于31；3)3個技術重復至少2個得到擴增的認定為有效擴增。篩選后的數據根據文獻計算相對豐度，公式為[33-34]：

接著，把樣品中目的基因的相對豐度通過16S rRNA基因的絕對定量數據轉化為目的基因的拷貝數。

1.4.2 數據分析

使用Microsoft Excel 2016對數據進行運算，用R語言2.14.0進行熱圖、主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)、冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)，用Origin Pro 9.0作圖。

2 結果(Results)

2.1 理化性質

廈門后溪中下游H6～H10位點濁度、營養鹽(總碳、總有機碳、總氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮、總磷、磷酸鹽)含量普遍高于上游與水庫位點。H7、H8位點濁度、營養鹽含量普遍高于其他位點，溶解氧含量低于其他位點(表4)。根據我國《地表水環境質量標準(GB3838—2002)》中限值[2]，上游與水庫H1～H5位點中，H1位點為地表水Ⅴ類水質，H4為Ⅲ類水質，H2、H3、H5為Ⅳ類水質，這些位點水質無法達到功能目標要求，主要由于總氮含量高，除總氮指標外，其他指標均達到地表水Ⅱ類水質標準。根據實地調查，流域上游果園面積比較大，上游與水庫總氮含量較高可能與果園施肥有關。中下游H6～H10位點均為劣Ⅴ類水質，主要表現為N、P污染，這些位點總氮含量均超標，此外，H7～H9位點氨氮含量超標，H6～H9位點總磷含量超標，尤其是H7～H9位點營養鹽超標較嚴重。

2.2 后溪微生物污染狀況

所用于檢測的分子標記物除了Chicken/duckND5標記物為自主設計，其余標記物均來自于已發表的文獻(表2, 表3)，據文獻報道具有較高的靈敏度與特異度。我們進一步對各分子標記物的探針和引物進行BLAST比對驗證表明探針和引物均具有較高特異性，這些分子標記物可用于后續檢測。通過高通量qPCR得到廈門后溪冬季各采樣點的微生物污染狀況，包括不同宿主來源的糞便污染(圖2)與病原微生物污染(圖3)。

圖2 采樣點不同宿主糞便指示分子標記物豐度(log10 copies·(100 mL)-1)Fig. 2 Concentration of fecal indicators (log10 copies·(100 mL)-1) from various hosts in sampling sites

圖3 采樣點病原微生物含量(log10 copies·(100 mL)-1)Fig. 3 Concentration of pathogens (log10 copies·(100 mL)-1) in sampling sites

上游和水庫H1～H5位點以及下游匯入杏林灣口H10位點未檢測出糞便污染，在中下游H6～H8和集美新城區H9位點檢測出糞便污染，且污染主要集中于點H7、H8。H6位點檢測出少量家禽源污染(4.0 log10copies·(100 mL)-1)及較高的豬源糞便污染(6.7 log10copies·(100 mL)-1)。H7和H8位點呈現出多種來源糞便污染，其中H7位點檢測到人類、反芻動物、家禽、狗的糞便污染，基因拷貝數范圍為4.3～6.3 log10copies·(100 mL)-1，人類、家禽來源的糞便污染為主要污染。H8位點檢測到人源、家禽源、狗源污染(4.1～6.1 log10copies·(100 mL)-1)，其污染程度與H7位點相近。H9位點檢測出少量的人類糞便污染，基因拷貝數值為4.7 log10copies·(100 mL)-1(圖2)。

用于檢測病原微生物的分子標記物包含了10個胃腸道病原微生物標記物、1個棘阿米巴屬(Acanthamoebaspp.)18S rRNA標記物、2個與肺炎相關疾病的病原微生物：克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)外膜磷酸孔蛋白標記物及軍團桿菌屬(Legionellaspp.)23S rRNA標記物。由圖3可以看出，病原微生物的檢出與糞便污染的檢出有著較相似規律：H1～H5、H9位點檢測出較少病原微生物，在H6～H8、H10位點檢測出較多病原微生物，且主要集中于點H8。各位點水體的總細菌含量與糞便污染、病原微生物的檢出也有著相似規律，即H1～H5水體總細菌含量較少(8.2～9.1 log10copies·(100 mL)-1)，H6～H10水體總細菌含量較多(9.4～9.7 log10copies·(100 mL)-1)。不同的是，H1～H10各位點均檢測出軍團桿菌，且其在水庫H2～H5位點的含量高于其他位點。所有位點檢測出的病原微生物含量均較少(3.9～5.3 log10copies·(100 mL)-1)。H2位點檢測出棘阿米巴；H6位點檢測出幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)與克雷伯氏肺炎桿菌；H7位點檢測出腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregativeE.coli)；H8位點檢測出較多病原微生物，包含產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、腸毒素型大腸桿菌(enterotoxigenicE.coli)、棘阿米巴、克雷伯氏肺炎桿菌；H10位點檢測出霍亂弧菌/副溶血弧菌(Vibriocholera/V.parahaemolyticus)。

2.3 PCA與RDA結果

2.3.1 PCA結果

對后溪流域各采樣點糞便污染與病原微生物污染進行PCA分析進一步證實各點的微生物污染狀況有著差異，特別是上游與水庫H1～H5位點集中聚集，微生物污染狀況相似； H9、H10與H1～H5位點距離較近，微生物污染狀況較為相近；生活產業區H7、H8位點距離較近，污染狀況相似，且遠離H1～H6、H9、H10位點，H7、H8微生物污染與這些位點差異較大(圖4)。對流域各采樣點理化性質進行PCA分析發現相似的規律：H1～H5位點較集中聚集，H7、H8與H1～H6、H10位點差異較大(圖5)。說明該流域微生物污染與理化性質有一定相關關系。

圖4 采樣點微生物污染狀況PCA圖Fig. 4 Principal component analysis of microbial contamination in sampling sites

圖5 采樣點理化性質PCA圖Fig. 5 Principal component analysis of physical and chemical properties in sampling sites

2.3.2 RDA結果

進一步對各采樣點微生物污染與理化性質進行RDA分析，得到后溪流域微生物污染與pH、濁度、溶解氧、硝酸鹽、亞硝酸鹽含量顯著相關(P<0.05)，這5個理化指標對流域微生物污染的解釋量為84.4%。H1～H5、H10位點pH、溶解氧含量較高，pH、溶解氧與這些位點微生物污染顯著正相關；反之，H7、H8位點pH、溶解氧含量較低，pH、溶解氧與H7、H8位點微生物污染顯著負相關。H7、H8位點濁度、營養鹽含量(硝酸鹽、亞硝酸鹽)高，濁度、硝酸鹽、亞硝酸鹽與H7、H8位點微生物污染顯著正相關；H1～H5、H9、H10位點反之亦成立(表4，圖6)。由于H7、H8位點微生物污染較嚴重，H1～H5、H9、H10位點微生物污染較小，由此可見后溪流域微生物污染與濁度、硝酸鹽、亞硝酸鹽含量顯著正相關，與pH、溶解氧含量顯著負相關。

圖6 采樣點微生物污染與理化性質RDA圖Fig. 6 Redundancy analysis depict the relationship between microbial contamination and physical and chemical properties in sampling sites

3 討論(Discussion)

本研究利用高通量qPCR對廈門市后溪流域進行了常見糞便污染源(人類、反芻動物、家禽、豬、狗)和病原微生物檢測，用以評估該流域微生物污染狀況。所有樣點均未檢出艱難梭菌、沙門氏菌(Salmonella)、金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、霍亂弧菌二元毒素基因(ctxA)污染。所有樣點均檢測出軍團菌屬23S rRNA標記物，且其在水庫H2～H5位點的含量高于其他位點，這與本研究中其他分子標記物、理化性質檢出的規律差異較大。據報導軍團菌屬中包含多種非致病菌種[35]，所使用的分子標記物為該菌的23S rRNA基因，涵蓋了該菌屬中的非致病菌株，因此該分子標記物可能不適合用于評估軍團菌病原微生物污染，后續研究中應針對致病軍團菌的特異基因進行。

后溪流域上游為水源地水與水庫蓄水(H1～H5位點)，水質較好，沒有檢測到糞便污染，且檢出的病原微生物數量與含量極少，微生物污染極小。但石兜水庫上游H2位點檢測出少量棘阿米巴(4.0 log10copies·(100 mL)-1)污染，近年來有報導棘阿米巴性角膜炎爆發可能與飲用水受到棘阿米巴污染有關[32]，該污染出現于水庫，應引起重視，并且需要進一步確認是否存在棘阿米巴污染。

H6～H8位點均檢測出糞便污染和病原微生物污染，H9位點檢測出少量人類糞便污染，H10位點檢測到病原微生物污染。H6樣點位于水庫下游，在該位點檢測到豬和家禽糞便污染，表明水體流出水庫后受到禽畜養殖污染(豬、家禽)。H7、H8樣點位于舊城區居民生活、產業區，這2個位點濁度、營養鹽含量普遍高于其他位點，溶解氧含量低于其他位點，N、P污染較為嚴重，為劣Ⅴ類水質，已無法滿足水質生態功能要求；這2個位點也檢測出最多的糞便污染與病原微生物污染，說明其受到較為嚴重的微生物污染。流域微生物污染主要來源于城市暴雨徑流、生活污水溢流、禽畜養殖、分散式污水處理系統、污水處理廠排水、流域底泥等[36]。人為因素，包括了人類生產、生活活動可能是H7、H8位點微生物污染的主要來源。H9、H10樣點位于集美新城區，居民區較少，規劃與配套污水管網、處理設施較為科學環保，且其上游的污染經過流域的稀釋、自凈降解作用，因此檢測出的微生物污染較少，但仍需進一步加強控制。值得注意的是，在H10位點檢測出少量霍亂弧菌/副溶血弧菌毒素基因(toxR)與霍亂弧菌外膜蛋白W基因(ompW)，說明H10位點有霍亂弧菌、副溶血弧菌污染；本研究中還有一個分子標記物針對霍亂弧菌二元毒素基因，二元毒素基因是強毒性基因[31, 37]，該位點未檢出霍亂弧菌二元毒素基因，說明H10位點病原微生物污染程度不高，但H10位點位于后溪流域匯入杏林灣的入?？冢撐稽c的污染很可能造成入?？谖廴荆铱赡軘U散污染，仍需引起重視。

此外，后溪流域微生物污染與流域理化性質密切相關，特別是營養鹽、濁度、pH、溶解氧。微生物污染狀況能進一步表征流域綜合污染狀況，對控制流域理化、微生物污染具有重要意義。

綜上表明，城鎮居民生活、生產活動是后溪流域微生物污染主要來源。后溪流域是廈門市小流域污染整治與水資源保護示范區，具有重要的水源涵養和生態功能，研究后溪流域污染狀況，特別是微生物污染狀況將有利于水資源保護與人類健康。本研究基于高通量qPCR技術對城市化小流域微生物污染狀況進行評估，同時對多種糞便污染源與病原微生物進行檢測，實現了更加快速、及時、科學、準確地發現糞便污染來源，評估水體微生物污染分布規律和特征，從而對流域微生物污染監管與控制提供更有效的依據。

[1] 楊勇, 魏源送, 鄭祥, 等. 北京溫榆河流域微生物污染調查研究[J]. 環境科學學報, 2012, 32(1): 9-18

Yang Y, Wei Y S, Zheng X, et al. Investigation of microbial contamination in Wenyu River of Beijing [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(1): 9-18 (in Chinese)

[2] 國家環境保護總局. GB3838—2002 地表水環境質量標準[S]. 北京: 中國標準出版社, 2002

Ministry of Environmental Protection of the People's Republic of China. GB3838—2002 Environmental quality standards for surface water [S]. Beijing: China Standard Press, 2002 (in Chinese)

[3] 世界衛生組織. 飲用水水質準則(第四版)[M]. 上海: 上海交通大學出版社, 2014: 87-232

World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality (Fourth Edition) [M]. Shanghai: Shanghai Jiaotong University Press, 2014: 87-232 (in Chinese)

[4] Simpson J M, Santo D J, Reasoner D J. Microbial source tracking: State of the science [J]. Environmental Science and Technology, 2002, 36(24): 5279-5288

[5] 王耀兵, 蘇潔, 楊玉敏, 等. 一種糞便污染源識別新技術——微生物源示蹤[J]. 海洋環境科學, 2008, 27(S2): 122-128

Wang Y B, Su J, Yang Y M, et al. New technology of identification of fecal pollution—— Microbial source tracking [J]. Marine Environmental Science, 2008, 27(S2): 122-128 (in Chinese)

[6] 段傳人, 劉愛喜, 王貴學, 等. 應用腸道微生物示蹤地表水糞便污染的研究進展[J]. 微生物學通報, 2013, 40(12): 2319-2329

Duan C R, Liu A X, Wang G X, et al. Research progress of using intestinal microbes to track the sources of fecal pollution in surface water [J]. Microbiology China, 2013, 40(12): 2319-2329 (in Chinese)

[7] Wiggins B A. Discriminant analysis of antibiotic resistance patterns in fecalstreptococci, a method to differentiate human and animal sources of fecal pollution in natural waters [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(11): 3997-4002

[8] Parveen S, Murphree R L, Edmiston L, et al. Association of multiple-antibiotic-resistance profiles with point and nonpoint sources ofEscherichiacoliin Apalachicola Bay [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(7): 2607-2612

[9] Scott T M, Rose J B, Jenkins T M, et al. Microbial source tracking: Current methodology and future directions [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(12): 5796-5803

[10] Harwood V J, Staley C, Badgley B D, et al. Microbial source tracking markers for detection of fecal contamination in environmental waters: Relationships between pathogens and human health outcomes [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2014, 38(1): 1-40

[11] 魏源送, 鄭嘉熹, 王光宇, 等. 地表水微生物溯源技術的開發和應用進展[J]. 水資源保護, 2016, 32(1): 1-11

Wei Y S, Zheng J X, Wang G Y, et al. Development and application progress of microbial source tracking in surface water [J]. Water Resources Protection, 2016, 32(1): 1-11 (in Chinese)

[12] 陳亞楠, 王亞煒, 魏源送, 等. 不同功能地表水體中病原微生物指示物的標準比較[J]. 環境科學學報, 2015, 35(2): 337-351

Chen Y N, Wang Y W, Wei Y S, et al. Evolution and standard comparison of indicator microorganisms for different surface waters [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2015, 35(2): 337-351 (in Chinese)

[13] Field K G, Samadpour M. Fecal source tracking, the indicator paradigm, and managing water quality [J]. Water Research, 2007, 41(16): 3517-3538

[14] Ferguson A S, Layton A C, Mailloux B J, et al. Comparison of fecal indicators with pathogenic bacteria and rotavirus in groundwater [J]. Science of the Total Environment, 2012, 431: 314-322

[15] 張崇淼, 王曉昌, 周進宏, 等. 城市地表水中腸道病原微生物與糞便污染指示菌的關系研究[J]. 環境科學學報, 2012, 32(11): 2789-2794

Zhang C M, Wang X C, Zhou J H, et al. Comparative study on enteric pathogens and their relations with fecal indicator bacteria in urban surface waters [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(11): 2789-2794 (in Chinese)

[16] 王寧, 黃友誼, 陳偉偉. 構建城市水系生態安全格局初探——以廈門市后溪為例[C]. 青島: 城市時代，協同規劃——2013中國城市規劃年會, 2013: 1-12

Wang N, Huang Y Y, Chen W W. A Preliminary study on establishing an ecological security pattern of urban water system—A case study of Houxi River, Xiamen [C]. Qingdao: City Times, Collaborative Planning-China Urban Planning Annual Meeting 2013, 2013: 1-12 (in Chinese)

[17] Liu L, Yang J, Yu X, et al. Patterns in the composition of microbial communities from a subtropical river: Effects of environmental, spatial and temporal factors [J]. PLOS One, 2013, 8(11): e81232

[18] Mieszkin S, Furet J P, Corthier G, et al. Estimation of pig fecal contamination in a river catchment by real-time PCR using two pig-specificBacteroidales16S rRNA genetic markers [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(10): 3045-3054

[19] Shanks O C, Kelty C A, Sivaganesan M, et al. Quantitative PCR for genetic markers of human fecal pollution [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(17): 5507-5513

[20] Lee C S, Lee J. Evaluation of newgyrB-based real-time PCR system for the detection ofB.fragilisas an indicator of human-specific fecal contamination [J]. Journal of Microbiological Methods, 2010, 82(3): 311-318

[21] Green H C, Haugland R A, Varma M, et al. Improved HF183 quantitative real-time PCR assay for characterization of human fecal pollution in ambient surface water samples [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(10): 3086-3094

[22] Schill W B, Mathes M V. Real-time PCR detection and quantification of nine potential sources of fecal contamination by analysis of mitochondrial cytochromebtargets [J]. Environmental Science & Technology, 2008, 42(14): 5229-5234

[23] Layton A, Mckay L, Williams D, et al. Development ofBacteroides16S rRNA gene TaqMan-based real-time PCR assays for estimation of total, human, and bovine fecal pollution in water [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(6): 4214-4224

[24] Kobayashi A, Sano D, Hatori J, et al. Chicken- and duck-associatedBacteroides-Prevotellagenetic markers for detecting fecal contamination in environmental water [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(16): 7427-7437

[25] Kildare B J, Leutenegger C M, Mcswain B S, et al. 16S rRNA-based assays for quantitative detection of universal, human-, cow-, and dog- specific fecalBacteroidales: A Bayesian approach [J]. Water Research, 2007, 41(16): 3701-3715

[26] Green H C, White K M, Kelty C A, et al. Development of rapid canine fecal source identification PCR-based assays [J]. Environmental Science and Technology, 2014, 48(19): 11453-11461

[27] Wroblewski D, Hannett G E, Bopp D J, et al. Rapid molecular characterization ofClostridiumdifficileand assessment of populations ofC.difficilein stool specimens [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2009, 47(7): 2142-2148

[28] Lee D Y, Shannon K, Beaudette L A. Detection of bacterial pathogens in municipal wastewater using an oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR [J]. Journal of Microbiological Methods, 2006, 65(3): 453-467

[29] Liu J, Gratz J, Amour C, et al. A laboratory-developed TaqMan Array Card for simultaneous detection of 19 enteropathogens [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2013, 51(2): 472-480

[30] Kobayashi D, Eishi Y, Ohkusa T, et al. Gastric mucosal density ofHelicobacterpyloriestimated by real-time PCR compared with results of urea breath test and histological grading [J]. Journal of Medical Microbiology, 2002, 51(4): 305-311

[31] Bliem R, Schauer S, Plicka H, et al. A novel triplex quantitative PCR strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenicVibriocholeraein aquatic environments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(9): 3077-3085

[32] Wang H, Edwards M, Falkinham J R, et al. Molecular survey of the occurrence ofLegionellaspp.,Mycobacteriumspp.,Pseudomonasaeruginosa, and amoeba hosts in two chloraminated drinking water distribution systems [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(17): 6285-6294

[33] Su J Q, Wei B, Ou-Yang W Y, et al. Antibiotic resistome and its association with bacterial communities during sewage sludge composting [J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(12): 7356-7363

[34] Zhu Y G, Zhao Y, Li B, et al. Continental-scale pollution of estuaries with antibiotic resistance genes [J]. Nature Microbiology, 2017, 2: 16270

[35] 路鳳, 金銀龍, 程義斌. 軍團菌病的流行概況[J]. 國外醫學(衛生學分冊), 2008(2): 78-83

Lu F, Jin Y L, Cheng Y B. Epidemiology of Legionella disease [J]. Foreign Medicine (Hygiene), 2008(2): 78-83 (in Chinese)

[36] James E S, Joyce M P. Assessment and management of watershed microbial contaminants [J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 2004, 34(2): 109-139

[37] Blackstone G M, Nordstrom J L, Bowen M D, et al. Use of a real time PCR assay for detection of thectxAgene ofVibriocholeraein an environmental survey of Mobile Bay [J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 68(2): 254-259