運動對2,3,7,8-TCDD持續染毒大鼠肝臟LXRa蛋白、ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達的影響

蔡愛芳，陸一帆

1. 山東體育學院, 濟南250102 2. 北京體育大學, 北京100084

伴隨著全球工業化進程的加速，大量化學物質被排放到環境中，造成了嚴重的環境污染。具有親脂性、生物富集性、難降解、高毒性等特點的持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)，對人體健康和生態系統造成了嚴重的危害。二噁英類(dioxins)就是一種典型的持久性有機污染物，其中毒性最強的是2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, 2,3,7,8-TCDD)，因其來源多、分布廣、毒性強等特點，成為二噁英家族中最受人們關注的一種環境污染物。最近越來越多的研究指出二噁英類可改變不同發育階段、不同細胞類型和組織中的一些激素系統，引起內分泌系統、免疫系統、生殖系統、骨骼系統等的紊亂，從而導致多種疾病[1-8]。目前全球代謝性疾病處于高發階段，大規模的流行病學調查發現，2,3,7,8-TCDD與胰島素抵抗及糖尿病發生顯著相關，并有調查發現接觸2,3,7,8-TCDD的工人體內2,3,7,8-TCDD含量與高水平甘油三酯、膽固醇相關性極高，接觸工人在隨后的35年內嚴重受到高血脂、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病的干擾[9-13]。

健康是人類生存、發展的基本要素，運動作為一種生活方式對健康的促進起著重要的作用。運動可以改善胰島素抵抗、血脂代謝、提高心肺耐力，能夠有效防治心腦血管及代謝性疾病[14-17]。目前，人體少量、持續接觸有機污染物的現象比較常見，2,3,7,8-TCDD 低劑量持續暴露對人體的潛在影響更為突出。但2,3,7,8-TCDD是否通過影響脂質合成代謝從而導致代謝性疾病的發病并沒明確，因此本研究擬通過研究2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝臟脂質合成代謝關鍵酶：脂肪酸合成酶(fatty acid synthetsae, FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase, ACC)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearyl coenzyme A desaturase, SCD) mRNA表達，轉錄因子肝X受體a(liver X receptor A, LXRa)蛋白表達，探討代謝性疾病發病機制，并對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠進行運動干預，試圖發現運動這種健康的生活方式能否改變二噁英類環境污染物對脂質合成代謝的影響，為探索環境健康風險的有效控制方法和手段提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物與分組

7周齡VAF/SPF級雄性SD大鼠24只，體重(235.45±12.28)g,購自北京維通利華實驗動物中心(許可證編號：SCXK(京)2012-0001)，實驗獲得北京體育大學動物福利倫理委員會批準(批準號：201210035)。北京體育大學實驗動物房分籠飼養，每籠4只，室溫(22.15±1.65) ℃,相對濕度(55.25%±8.65%)，晝夜交替時間12 h，國家標準嚙齒類動物常規飼料喂養，自由飲水(高壓滅菌)、飲食。24只SD大鼠適應性喂養并適應性運動1周后按體重隨機分為3組：對照組(C組)、染毒組(T組)、運動染毒組(ET組)，每組8只。

1.2 實驗染毒劑量及運動方案

將2,3,7,8-TCDD(純度>99.5%；Cambridge Isotope Laboratory，Andover，MA，USA)溶于玉米油中，T組、ET組按6.4 μg·kg-1(以單位體重計)的劑量給予腹腔注射，C組給予腹腔注射等量的玉米油。之后每隔1周給予上述劑量的21%持續染毒[18]，連續7周。ET組尾部5%體重[19]負重進行游泳運動，每周游泳5 d，每次游泳30 min，游泳池體積為 140 cm×54 cm×43 cm，水深35 cm，游泳池水溫(30±2) ℃。在游泳過程中，時刻觀察大鼠游泳狀態，發現有沉水，撈出水面休息十幾秒放入水中繼續游泳。C組、T組在ET組進行游泳訓練的同時在水中自由浸泡 30 min，水深15 cm，水溫(30±2) ℃。

1.3 動物組織取材

實驗第8周末前一天給予大鼠禁食8 h，取材前稱重，用20%的烏拉坦以5 mL·kg-1劑量進行腹腔麻醉。腹主動脈取血處死，快速分離肝臟組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，稱重并記錄，手術剪分割成200 mg左右小塊，錫紙包裹，投入液氮保存，取材結束后轉移至-80 ℃冰箱備用。

1.4 測試指標及方法

1.4.1 肝臟甘油三酯(triglyceride,TG)測定

取大鼠肝臟0.5 g，剪碎，置于裝有3倍體積甲醇的離心管中，用組織勻漿器粉碎，后向勻漿中加入6倍體積的氯仿，充分混勻，靜置18 h后，3 000 r·min-1離心10 min，小心抽取下層脂質相，用組織TG試劑盒(中國中生北控生物科技有限公司)，全自動生化分析儀(COBAS6000,德國羅氏公司)測定。

1.4.2 肝臟組織ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達測定

用超純RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取肝臟樣本中總RNA。通過OD260/230、 OD260/280來判定RNA純度，OD260/280在1.9～2.1之間RNA純度較好。常規瓊脂糖凝膠電泳成像，28S和18S條帶完整，并28S條帶的量是18S條帶的2倍，說明RNA完整性較好。用DNase1(CWbio. Co. Ltd, Cat# CW2090)對RNA進行處理，以消化RNA中含有的基因組DNA。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744A)進行反轉錄，用UltraSYBR Mixture(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0956D)進行擴增，擴增產物取5 μL進行電泳，擴增產物為單一目的條帶，說明擴增產物的特異性非常好。

引物設計：在pubmed網站搜索相應脂代謝基因的mRNA序列，應用引物設計軟件Primer Premier5.0進行引物設計，所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列如下。

ACC1(169 bp) F:5'GATTTTTTGATTATGGCTCTTTCTC3'，R: 5'TTGGCTTCAGAATCCAGGTTTG3'；FAS(128 bp) F:5'GGCATTATCTTGGAAGCGATGGGTA3'，R: 5'AAACTGCTCAGGACTGCGTGGG3'；SCD1(199 bp) F: 5'ACACGCCGACCCTCACAACTC3'，R: 5' CAGTGTGGGCAGGATGAAGCA3'；β-actin(150 bp) F: 5' GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3'，R: 5'GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG3'。

擴增程序：95 ℃，10 min；(95 ℃，15 s；60 ℃，60 s)×40個循環。數據分析：采用相對定量法2-△△CT計算各基因mRNA的表達水平，目的基因相對變化倍數=2-△△CT，2-△△CT=[(CT靶基因-CT內參基因)實驗組-(CT靶基因-CT內參基因)對照組]。

1.4.3 肝臟組織LXRa蛋白測定

Western blot檢測蛋白表達，蛋白抽提試劑盒(Sinoble公司)進行組織蛋白抽提，BCA蛋白定量試劑盒(Sinoble公司)進行蛋白濃度測定。根據目的蛋白的分子量配制8%分離膠，5%濃縮膠，進行上樣、電泳、轉膜、封閉、一抗孵育LXRa(Sinoble Mouse LXRa antibody ab41902，Abcam公司，抗體稀釋比例1:4 000，4 ℃過夜)、洗膜、二抗孵育(山羊抗小鼠IgG，Jackson公司，稀釋比例1:10 000)、洗膜、曝光。膠片掃描，采用Image Pro Plus圖像分析系統測定目的條帶的光密度值(OD)，GAPDH校正，計算目的蛋白表達的相對值。

1.5 數據統計學分析

實驗數據用均數±標準差(Mean±SD)表示，SPSS 17.0軟件進行統計分析。實驗數據分析前進行正態分布Kolmogorov-Smirnov檢驗，非正態分布數據用Box-Cox轉換為近似正態分布。各組之間的比較分析采用Compare Means中One-Way ANOVA。P<0.05為具有統計學差異。

2 結果(Results)

2.1 大鼠體重、肝臟相對重量

大鼠體重、肝臟相對重量如表1所示，與C組相比，T組、ET組體重明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)、肝臟相對重量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 大鼠肝臟組織TG含量

大鼠肝臟TG含量如圖1所示，與C組相比，T組肝臟TG含量明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)，與T組相比，ET組肝臟TG含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 大鼠肝臟脂質合成代謝相關酶ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達

大鼠肝臟脂質合成代謝相關酶mRNA表達如圖2所示，2,3,7,8-TCDD持續染毒8周，T組、ET組脂質合成代謝相關酶ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達與C組比較均升高,差異有統計學意義(P<0.01)。持續8周游泳運動并伴有2,3,7,8-TCDD染毒ET組脂質合成代謝相關酶ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達與T組比較均降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 運動對TCDD染毒大鼠肝組織甘油三酯(TG)含量的影響Fig. 1 The effect of exercise on the level of liver triglyceride (TG) of rats after exposure to TCDD

圖2 運動對TCDD染毒大鼠肝組織脂質合成代謝相關酶ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達相對值的影響Fig. 2 The effect of exercise on the relative expression of the crucial enzymes during liver lipid metabolism of rat after exposure to TCDD

2.4 大鼠肝臟脂質合成代謝轉錄因子LXRa蛋白相對表達

大鼠肝臟LXRa蛋白相對表達如圖4所示，持續8周2,3,7,8-TCDD染毒T組、ET組大鼠肝臟LXRa蛋白相對表達與C組比較均增加，差異有統計學意義(P<0.01)，ET組大鼠肝臟LXRa蛋白相對表達與T組比較降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖3 大鼠肝組織LXRa、內參GAPDH蛋白電泳條帶示例Fig. 3 The sample of electrophoretic bands of liver LXRa, GAPDH protein of rats

圖4 運動對TCDD染毒大鼠肝組織脂質合成代謝轉錄因子LXRa蛋白相對表達的影響Fig. 4 The effect of exercise on the relative level of the transcriptional factor LXRa protein during liver lipid metabolism of rats after exposure to TCDD

表1 各組大鼠體重、肝臟相對重量Table 1 The body weight and relative liver weight of rats

注：C, 對照組; T, 染毒組; ET, 運動染毒組。與C組相比，**P<0.01。

Note： C, Control group; T, Toxic group; ET, Exercise toxic group. Compared with C group,**P<0.01.

3 討論(Discussion)

目前環境污染問題日益嚴重，環境因素對身體健康的影響逐漸引起人們更多的關注。二噁英這類難降解、并具有生物富積性的環境污染物對人類健康的影響逐漸被研究者證實。大規模流行病學調查發現二噁英類作為一種持久性有機污染物，增加了代謝性疾病的發病風險[20-24]。

3.1 運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠體重、肝臟相對重量的影響

Ciftci等[25]研究發現2 μg·kg-1(以單位體重計)2,3,7,8-TCDD就可以明顯減緩Wistar 大鼠體重的增長。本研究結果顯示2,3,7,8-TCDD染毒8周后，T組、ET組大鼠體重比正常對照組C組大鼠體重低，差異有統計學意義(P<0.01)，這與前人文獻報道一致，充分說明了2,3,7,8-TCDD能夠改變大鼠體重的自然增長趨勢。據文獻報道，適宜強度的有氧運動可減控大鼠體重[26-29]，本研究結果ET組大鼠體重最低，認為這是運動和2,3,7,8-TCDD雙重作用的結果。

肝臟腫大是簡易評價肝臟毒性的一個指標，大量研究證實2,3,7,8-TCDD染毒后以肝臟腫大、實質細胞增生與肥大為共同肝臟毒性特征[30-32]。本研究8周末處死動物時發現C組大鼠肝臟顏色鮮紅，大小無異常，而T組、ET組大鼠肝臟明顯增大，觸之有油膩感。并且T組、ET組肝臟相對重量與C組比較顯著增加，有統計學差異(P<0.01)。這與前人文獻報道肝毒性特征一致。2,3,7,8-TCDD染毒大鼠出現肝臟毒性的組織表觀表現，勢必會影響到肝臟生理功能。而肝臟是脂質從頭合成的主要部位，可能會影響到肝臟中脂質代謝的合成。

3.2 運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝臟組織甘油三酯的影響

肝臟、脂肪組織及小腸是合成甘油三酯、膽固醇的主要場所，以肝臟的合成能力最強。肝細胞能合成脂肪，但不能儲存脂肪。甘油三酯合成后，與磷脂、膽固醇結合，與載脂蛋白B100、C等生成極低密度脂蛋白(VLDL)，再分泌入血運輸至肝外組織，提供給其他組織器官利用。肝臟合成甘油三酯的量超過了其合成和分泌VLDL的能力，甘油三酯便積存在肝內。2,3,7,8-TCDD染毒8周后， T組肝臟甘油三酯明顯高于C組、ET組，差異有統計學意義(P<0.01)。C組、ET組肝臟甘油三酯無明顯差異(P>0.05)。分析認為2,3,7,8-TCDD持續染毒會誘導肝臟合成甘油三酯，超過了肝臟代謝能力促使多余的甘油三酯存積在肝臟組織中。而ET組雖然也持續染毒，但由于規律持續的運動，甘油三酯在肝臟中積聚量相對較少，說明游泳運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝臟甘油三酯沉積有一定的干預作用。

3.3 運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝臟組織LXRa的影響

LXRa是肝臟脂肪代謝的主要推動者，大量研究發現LXRa可通過調節膽固醇7a-羥化酶、ATP結合盒轉運蛋白G5、ATP結合盒轉運蛋白G8、ATP結合盒轉運蛋白A1、磷酸酰轉移蛋白、載脂蛋白E、固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP)等基因表達水平[33-36]，對維持體內脂代謝平衡起重要作用。Peet等[37]首次報道LXRa缺乏，小鼠肝內SREBP1c及其靶基因FAS、SCD1的表達都減少。隨后陸續有研究者發現LXR對ACC、FAS、SCD1基因可以不通過SREBP1來介導，ACC、FAS、SCD1基因啟動子上均含有LXRs結合位點，可直接接受LXR的調控[38-39]。LXR可引起生脂基因表達上調，增加脂肪酸的合成并使肝內聚集大量的甘油三脂，提高血漿中甘油三酯的水平[40]。

本實驗研究結果顯示T組、ET組肝臟組織中LXRa蛋白表達均明顯增高，與C組比較有統計學差異(P<0.01)，表明2,3,7,8-TCDD持續染毒可以誘導LXRa蛋白表達的增加，增高的LXRa作為脂肪合成代謝的推動者，能夠通過LXR-SREBP1c途徑進而促進下游脂質合成代謝關鍵酶ACC、FAS、SCD1的基因和蛋白表達，或直接促進其靶基因ACC、FAS、SCD1的表達，從而使脂肪合成增加，積聚在肝臟組織中。肝臟合成的甘油三酯主要由VLDL運輸到肝外組織，VLDL的甘油三酯在脂蛋白酯酶(LPL)的作用下逐步水解，可見能夠影響LPL活性的因素都會影響到肝臟甘油三酯的代謝。Angptl3(Angiopoietin-like 3)是一種肝特異性分泌蛋白，能夠抑制LPL活性，從而延緩甘油三酯代謝。Inaba等[41]發現Angptl3是LXR的直接靶點，LXR能增加肝臟合成Angptl3，增加的Angptl3通過抑制LPL 活性參與脂代謝的調節，延緩甘油三酯分解代謝。本研究T組、ET組肝臟組織中LXRa蛋白表達明顯高于C組(P<0.01)，可能通過合成更多Angptl3，致使LPL活性抑制，使得T組、ET組大鼠肝臟甘油三酯明顯增高。雖2,3,7,8-TCDD染毒造成T組、ET組肝臟組織中LXRa蛋白表達均明顯增高，但T組、ET組之間LXRa蛋白表達還是有明顯差異，ET組大鼠肝臟LXRa蛋白表達相對較低(P<0.01)。有關運動對LXRa蛋白表達的報道很少，結果也不盡一致， Rocco等[42]報道膽固醇酯轉運蛋白(CETP)轉基因小鼠進行6周有氧運動，能夠明顯提高膽固醇的逆向轉運，但肝臟中LXR蛋白表達水平沒有變化。但Kazeminasab等[43]報道雄性Wistar大鼠進行耐力訓練可以使肝臟中LXR mRNA表達明顯升高，提高膽固醇的逆向轉運，對預防動脈粥樣硬化有積極的作用。本研究發現運動可以降低2,3,7,8-TCDD染毒大鼠脂質合成代謝關鍵轉錄因子LXRa蛋白表達，我們分析可能是運動下調了LXRa蛋白表達，從而使的甘油三酯的合成代謝相對T組延緩，對LPL活性抑制作用也較T組減弱，使得ET組大鼠肝臟甘油三酯含量低于T組大鼠(P<0.01)。

3.4 運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝臟LXRa蛋白靶基因ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達的影響

ACC、FAS 和 SCD1是肝臟脂質從頭合成的3個重要的關鍵酶。ACC催化丙二酰單酰輔酶A生成，是脂肪酸合成的第一步反應。FAS是動物體內長鏈脂肪酸合成的最后一步關鍵酶。SCD是肝細胞合成單不飽和脂肪酸的限速酶，具有催化飽和脂肪酸的脂酰輔酶A脫氫的作用。本研究結果顯示，T組、ET組大鼠肝臟ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達升高，與C組比較有統計學差異(P<0.01)，分析認為2,3,7,8-TCDD染毒導致上游的LXRa蛋白表達增高，從而出現LXRa蛋白靶基因ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達升高。

許多學者研究發現，ACC、FAS在多種癌組織中呈高表達。Yahagi等[44]研究發現，小細胞肝癌組織中脂肪酸合成異常活躍，檢測顯示脂肪酸合成的關鍵酶ACC、FAS mRNA表達增高，并呈協同作用。動物實驗已證實二噁英具有很強的致癌性，國際癌癥研究機構已把二噁英列為一級致癌物。SCD的表達量會改變生物膜磷脂的組成，生物膜的流動性、通透性和完整性在細胞間物質轉運和生物信號傳導過程中起著非常重要的作用。大量研究認為，生物膜磷脂組分發生改變往往與肥胖、脂肪肝、糖尿病及癌癥等許多慢性疾病狀態相關。SCD的正常表達和調控對維持機體的生理狀態和體內脂質內環境的穩定具有重要作用。本實驗T組、ET組大鼠肝臟ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達升高是由8周2,3,7,8-TCDD持續染毒造成的異常表達。

Rector等[45]研究發現肥胖大鼠進行16 周運動，脂肪酸氧化明顯增加，脂肪酸從頭合成的關鍵酶ACC1 mRNA表達降低70%，FAS mRNA表達降低35%。Yasari等[46]發現大鼠進行8周運動訓練，肝臟中SCD mRNA和蛋白表達均降低。這說明進行長期、持續的運動鍛煉有利于減少脂肪的合成。ET組肝臟ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達明顯低于T組(P<0.01)，表明8周規律游泳運動可以抵抗2,3,7,8-TCDD染毒引起肝臟中ACC1、FAS、SCD1 mRNA表達的加強，減少脂肪合成。

綜上所述，2,3,7,8-TCDD持續染毒8周可上調脂質合成代謝關鍵酶ACC1、FAS、SCD1 mRNA的表達及轉錄因子LXRa蛋白的表達，從而造成脂質代謝紊亂，肝臟甘油三酯沉積。而8周有氧運動降低了ACC1、FAS、SCD1 mRNA、LXRa蛋白表達，有效改善了脂質代謝的紊亂，降低了甘油三酯在肝臟中的沉積，提示運動干預可以改善二噁英類污染物造成的肝臟脂質代謝紊亂。

致謝：感謝華南師范大學體育科學學院李婷博士后在文章修改中給予的幫助。

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