PM2.5對人肺癌細胞A549遷移、侵襲能力的增強作用

楊丹，周偉強，楊彪，肖純凌,*

1. 沈陽醫學院 藥理學教研室，沈陽 110034 2. 沈陽醫學院 遼寧省環境污染與微生態重點實驗室，沈陽 110034

PM2.5是指空氣動力學直徑≤2.5 μm的顆粒物，是構成可吸入顆粒物的主要部分[1]。眾多流行病學調查均顯示PM2.5與包括肺癌在內的呼吸系統疾病關系密切[2]。長期的PM2.5暴露能明顯增加肺癌患者的死亡率，同時可致確診后的肺癌患者的生存期縮短，說明PM2.5能夠促進肺癌的進展[3-4]。肺癌的進展與其轉移密切相關，有研究表明：PM2.5可能通過促進腫瘤新生血管形成、誘發炎癥反應等促進肺癌轉移，但其促進肺癌轉移的具體機制仍不清楚[5-7]。以往對于PM2.5致呼吸系統損傷的分子機制的研究多集中于以較高濃度PM2.5所致的細胞損傷作用，而關于PM2.5對腫瘤細胞遷移及侵襲能力影響的實驗研究仍較少，因此有必要進行更多及更深入的研究[8-11]。

本研究采用細胞劃痕實驗和transwell小室法檢測PM2.5對人肺癌細胞A549遷移、侵襲能力的影響，以期進一步證實PM2.5具有促肺癌轉移的作用。同時本研究采用Western Blotting法檢測同細胞遷移、侵襲能力密切相關的Wnt/βcatenin通路活性及其下游cyclin D1、MMP-2、MMP-9和轉錄因子snail、slug蛋白表達水平的變化，分析該信號通路在PM2.5影響肺癌細胞A549遷移、侵襲能力中的作用，為今后深入研究PM2.5促肺癌轉移的機制提供實驗依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細胞株和主要試劑

人肺癌細胞A549購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。胰酶及RPMI 1640培養基(Gibco公司)； Matrigel基質膠(BD公司)；transwell小室(Costar公司)；snail和slug抗體(CST公司)；MMP-2、MMP-9、β-catenin及cyclin D1抗體(Santa Cruz公司)；細胞核蛋白抽提試劑盒(碧云天公司)。

1.2 PM2. 5 采集和處理

選擇遼寧省沈陽市為采樣地區，采樣地點為城市中心。霧霾天氣時運用高流量樣品顆粒采集器采集PM2.5樣品于濾膜上，采樣高度為距離地面約1.5 m。連續自動采樣6個月，以1.13 m3·min-1流速每48 小時采集1份。采樣后的濾膜用鋁箔紙包裹后于-20 ℃冰箱中保存。制備PM2.5懸液時將采樣后的濾膜剪成約1 cm ×1 cm大小，浸泡在50 mL去離子水中。超聲震蕩收集PM2.5顆粒物，用多層紗布過濾震蕩液后制成PM2.5懸液。收集PM2.5懸液在13 000×g、4 ℃ 的條件下離心10 min后的底層顆粒物，高壓滅菌后真空冷凍干燥，-80 ℃保存。染毒前用無菌生理鹽水配制成所需的PM2.5混懸液并超聲處理[12-13]。

1.3 細胞培養及處理

人肺癌A549細胞株用RPMI 1640培養基(含10%新生牛血清、1% L-谷氨酰胺及1%青鏈霉素)培養于37 ℃、5 %CO2細胞培養箱中，細胞長滿約90%時傳代。取對數生長期的A549細胞，接種于培養皿或培養板內，于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后更換不含血清及抗生素的RPMI 1640培養基。次日向培養基中加入不同濃度PM2.5或TGF-β1(10 ng·mL-1)后持續培養72 h。

1.4 MTT 比色法檢測細胞增殖

設立實驗組(PM2.5終濃度為2.5、10、40和160 μg·mL-1)、對照組(只加細胞，不加PM2.5)和空白組(不加細胞，只加RPMI 1 640培養基及PM2.5)。體外培養72 h后，每孔加入20 μL MTT (終濃度5 g·L-1)，37 ℃繼續孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO 振蕩10 min，用酶標儀在490 nm處測定吸光度(A)值，實驗重復3次。按公式計算：

細胞生長抑制率=(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%

1.5 細胞劃痕實驗

1.6 Transwell小室侵襲、遷移實驗

細胞分組同劃痕實驗。侵襲實驗取200 μL細胞懸液種于鋪好Matrigel膠的Transwell上室中，下室加入600 μL含10%血清的培養基，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育24 h，移出transwell小室，棉簽擦去上室的非遷移細胞，4%甲醛固定30 min后用0.1%結晶紫染色15 min，沖洗干凈后倒置風干。在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每個小室隨機取6個視野拍照，計數穿膜細胞個數。細胞遷移試驗不需要鋪Matrigel膠，其余操作同侵襲實驗。

1.7 胞核蛋白的抽提

按照細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明進行。用PBS洗一遍，刮下細胞，每20 μL細胞沉淀加入200 μL細胞漿蛋白抽提試劑A。最高速劇烈渦旋5 s，冰浴10～15 min。加入細胞漿蛋白抽提試劑B 10 μL，最高速劇烈渦旋5 s，冰浴1 min，4 ℃、13 000×g離心5 min。收集沉淀，加入50 μL細胞核蛋白抽提試劑。最高速劇烈渦旋30 s，把細胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1～2 min再高速劇烈渦旋30 s，共30 min。4 ℃、13 000×g離心10 min，立即吸取上清，即為抽提得到的細胞核蛋白。

1.8 Western Blotting

收集細胞總蛋白，SDS - PAGE電泳后轉印到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液常溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃反應過夜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下反應0.5 h，化學發光法顯影；利用Image J 軟件對目的條帶進行灰度值檢測，以β-actin為內參照分析蛋白相對表達量。

1.9 統計學處理

2 結果(Results)

2.1 PM2.5對A549細胞增殖抑制作用

PM2.5處理A549細胞72 h后采用MTT 法檢測各組吸光度，計算PM2.5對A549細胞的增殖抑制率。如圖1和表1所示，與對照組比較，2.5、10、40和160 μg·mL-1PM2.5組對A549細胞的增殖抑制率隨濃度升高而增加，分別為(3.08% ± 3.73%)、(10.37% ± 5.97%)、(34.00% ± 6.39%) 和(51.01% ± 8.37%)。 選取對A549細胞增殖抑制作用較弱的2個濃度(2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1)進行后續實驗。

圖1 PM2.5對A549細胞的生長抑制作用Fig. 1 Inhibition of PM2.5 on growth of A549

表1 PM2.5對A549細胞的生長抑制作用Table 1 Inhibition of PM2.5 on growth of A549

注：與對照組比較，*為P<0.05。

Note： compared with control group，*P<0.05.

圖2 PM2.5促進A549細胞的遷移和侵襲注: A為細胞劃痕實驗檢測A549細胞遷移能力(×50)；2B為Transwell法檢測A549細胞遷移能力(a～d)和侵襲能力(e～h)(×200) 。Fig. 2 PM2.5 promotes migration and invasion of A549 cellsNote: A showed the migration ability of A549 cells detected by wound healing assay (×50); B showed the migration ability (a-d) and invasion ability (e-h) of A549 cells detected by transwell assay (×200).

圖3 Western Blotting 法檢測PM2.5 處理72 h后細胞核內β-catenin蛋白表達的變化注：與對照組比較，*為 P<0.05。Fig. 3 The expression levels of β-catenin proteins after exposure to PM2.5 for 72 h were analyzed by Western BlottingNote: compared with control group, *P<0.05.

2.2 PM2.5可增強A549細胞的遷移、侵襲能力

劃痕實驗結果如圖2A和表2所示：劃痕后24 h，對照組創面愈合率為(31.97%±1.80%)、2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1PM2.5組創面愈合率分別為(37.59%±3.08%)和(46.34%±5.19%)。與對照組相比，10 μg·mL-1PM2.5組A549細胞的創面愈合率明顯增加(P<0.05)。Transwell小室法遷移和侵襲實驗結果如圖2B和表2 所示：對照組、2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1PM2.5組中穿過基膜的細胞數分別為(118.67 ± 4.5) 個和(32.33 ±2.73) 個，(122.50 ± 6.53) 個和(35.5 ± 5.17) 個，(165.67 ± 6.62) 個和(47.83 ± 2.04) 個。與對照組相比，10 μg·mL-1PM2.5組小室濾膜下表面的細胞個數明顯增多(P<0.05)。上述結果表明10 μg·mL-1PM2.5可使A549細胞的遷移、侵襲能力增高。

2.3 PM2.5增強A549細胞Wnt/β-catenin信號通路活性

表2 PM2.5促進A549細胞的遷移和侵襲Table 2 PM2.5 promotes migration and invasion of A549 cells

注：與對照組比較，*為P<0.05。

Note： compared with control group,*P<0.05.

PM2.5處理A549細胞后，Western Blotting 法檢測細胞核內β-catenin蛋白表達的變化。結果如圖3和表3所示：給予A549細胞2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1的PM2.5處理72 h后，與對照組相比，10 μg·mL-1PM2.5組細胞核內β-catenin蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)。

2.4 PM2.5上調A549細胞中cyclin D1、snail、slug、MMP-2 和MMP-9的蛋白表達

PM2.5處理A549細胞后，Western Blotting 法檢測細胞內cyclin D1、snail、slug、MMP-2 和MMP-9蛋白表達的變化。結果如圖4和表4所示：給予A549細胞2.5 μg·mL-1和10 μg·mL-1的PM2.5處理72 h后，與對照組相比，10 μg·mL-1PM2.5組細胞內cyclin D1、snail、slug、MMP-2 和MMP-9的蛋白表達明顯增高(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

表3 PM2.5對肺癌A549細胞核內β-catenin蛋白相對表達的影響Table 3 The effect of PM2.5 on the expression of β-catenin protein in A549 cells nucleus (±s，n=6)

注：與對照組比較，*為P<0.05。

Note： compared with control group,*P<0.05.

圖4 Western Blotting 法檢測加入PM2.5 72 h后細胞內cyclin D1、snail、slug、MMP-2 和MMP-9蛋白表達的變化注：與對照組比較，*為 P<0.05。Fig. 4 The expression levels of cyclin D1, snail, slug, MMP-2 and MMP-9 proteins after treated with PM2.5 for 72 h were analyzed by Western BlottingNote: compared with control group, *P<0.05.

注：與對照組比較，*為P<0.05。

Note： compared with control group,*P<0.05.

腫瘤細胞的轉移是肺癌患者復發以及治療失敗的重要原因。以往關于PM2.5對肺癌影響的研究多集中其致癌細胞損傷或者死亡的作用方面[10, 14-16]，而關于PM2.5是否可促進肺癌的早期轉移的研究尚少見報道。本研究通過transwell遷移、侵襲實驗和細胞劃痕實驗檢測PM2.5對肺癌A549細胞遷移、侵襲能力的影響，結果顯示在無血清條件下較低濃度(10 μg·mL-1)的PM2.5作用72 h即可明顯增強肺癌細胞遷移、侵襲能力，說明PM2.5可能具有促進肺癌的早期轉移的作用。

腫瘤細胞的轉移過程非常復雜，涉及多條信號通路、轉錄因子及酶的活化。Wnt/β-catenin信號傳導通路在腫瘤細胞轉移過程中起著重要作用，該通路激活時，過量的β-catenin從胞質中轉移入細胞核，在核內與轉錄因子T細胞因子/淋巴增強因子(T cell factor, TCF/lymphoid enhancer factor, LEF)相互作用，激活下游大量具有促進腫瘤細胞轉移功能的基因轉錄，如基質金屬蛋白酶、cyclin D1、slug、snail等，進而增強腫瘤細胞轉移能力[17-20]。本研究通過檢測細胞核內β-catenin的表達水平證明在無血清條件下較低濃度的PM2.5(10 μg·mL-1)作用72 h即可明顯激活肺癌A549細胞Wnt/β-catenin信號通路。

基質金屬蛋白酶家族是降解細胞外基質的重要酶類。腫瘤細胞周圍細胞外基質的降解是腫瘤侵襲和轉移的必要條件，因此金屬蛋白酶家族在腫瘤細胞遷移和侵襲過程中發揮重要作用。多種腫瘤(包括非小細胞肺癌)中均可見金屬蛋白酶家族過表達。基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9是基質金屬蛋白酶家族內的重要成員，同屬于IV型明膠酶，主要降解細胞間基質及基底膜主要成分IV型膠原，促進腫瘤細胞侵襲和擴散，因此其在腫瘤轉移過程中具有重要作用[20-21]。研究表明：Wnt/β-catenin信號通路的激活能夠使MMP-2和MMP-9的表達水平增高[18]。如Dong等[22]的研究表明：電離輻射可通過激活Wnt/β-catenin信號通路使其下游包括MMP-2和MMP-9在內的多種基因表達上調，增強膠質瘤細胞U87侵襲能力。本研究中Western Blotting實驗結果表明：在無血清條件下較低濃度(10 μg·mL-1)的PM2.5作用72 h即可使MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的上調，說明PM2.5增強肺癌A549細胞遷移、侵襲能力作用與其激活Wnt/β-catenin信號通路并通過上調其下游MMP-2和MMP-9蛋白表達相關。

cyclin D1是細胞周期蛋白家族的一個成員，在調控細胞周期進展過程中發揮重要作用，此外cyclin D1還是一個癌基因，在多種腫瘤包括肺癌中呈高表達[23-24]。越來越多的研究表明，cyclin D1與腫瘤的轉移關系密切[25]。如Li等[26]的報道稱，cyclin D1通過抑制ROCK信號和轉移抑制因子TSP-1而增強細胞的運動能力。此外，細胞周期蛋白D1提高MMPs的表達和活性，從而提高侵襲性。如Arato-Ohshima等[27]的研究表明cyclin D1蛋白的過度表達可增加MMP-2和MMP-9的活性并增強腦膠質瘤細胞的侵襲性。

鋅指蛋白轉錄因子snail超家族包括snail(snail 1)和slug (snail 2)2個成員，二者作為轉錄因子，調控某些基因的表達，如下調細胞間的緊密連接成分如ZO-1及上調腫瘤細胞的金屬蛋白酶類的表達，這些均有助于增加細胞的遷徙轉移力，尤其常見于各種腫瘤的癌性細胞向遠處轉移機制中[28-32]。如Wang等[33]的研究表明：snail促進MMP-9表達，并且二者均與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移有關。Li等[34]報道snail介導的MMP-2上調與細胞侵襲性增強有關。Qiao等[35]關于口腔鱗狀細胞癌的研究證明：snail通過上調MMP-2和MMP-9促進細胞發生上皮間質轉化，轉移能力增強。Bolos等[36]和Chandler[37]研究發現，slug通過調控靶基因MMP-2影響細胞Ⅳ型膠原和明膠的降解，進而參與腫瘤細胞的侵襲與轉移。Qiao等[35]和Yue等[38]報道slug能夠上調MMP-9的表達。Wnt/β-catenin信號轉導途徑可調控snail和slug表達水平，當Wnt信號被激活，穩定的β-catenin進入細胞核內與TCF/LEF相互作用，形成的復合物可使snail和slug轉錄，核內水平增加[39]。

本研究中較低濃度的PM2.5(10 μg·mL-1)作用72 h即可明顯上調cyclin D1、snail和slug的蛋白表達水平，說明Wnt/β-catenin信號通路激活同時上調了某些其下游蛋白的表達，而這些蛋白的高表達又可進一步上調MMP-2和MMP-9的表達，促進腫瘤細胞的轉移和侵襲。

綜上所述，本研究發現將人肺癌A549細胞在無血清條件下暴露于較低濃度的PM2.5(10 μg·mL-1)72 h，能夠使細胞的侵襲、轉移能力增強，此作用與PM2.5活化Wnt/β-catenin信號傳導通路，上調細胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9及轉錄因子snail和slug的蛋白表達水平有關。

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