DEHP對小鼠精原細胞Bax和Bcl-2表達水平的影響

董瑞娜，劉殊，張敏，戴紅, *，徐肖倩, #

1. 內蒙古醫科大學，呼和浩特 010110 2. 同煤集團職業病防治院，大同 037003 3. 包頭醫學院，包頭 014040

現今，塑料制品已廣泛深入人類生產和生活。為使其滿足人們不同需求，塑料生產過程中使用和消耗了大量的增塑劑，據報道估計，增塑劑年均全球總產量580萬t，其中75%為鄰苯二甲酸酯(phthalatic-acid esters, PAE)類化合物[1]。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di (2-ethylhexyl)phthalate, DEHP)是PAE的重要組成之一，因它含有與聚合物相容的極性部分和能夠破壞聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)聚合物鏈之間極性相互作用的非極性部分且不與PVC形成共價鍵，所以，其很容易釋放到環境中，并通過直接接觸和使用進入人體，或通過其他PAEs產品以及一般環境間接暴露[2]。

近年來，大量研究證實DEHP對嚙齒類動物具有生殖和睪丸毒性及抗雄激素效應。根據暴露劑量及作用對象年齡的不同，均表現出不同程度的組織及細胞損傷，即出現睪丸、附睪萎縮，精細管畸形，生殖細胞、支持細胞及間質細胞凋亡。DEHP暴露也可改變生殖激素水平，導致血清中睪丸睪酮減少，精子死亡率和畸形率明顯增高。流行病學研究報道PAEs暴露可能導致男性生殖毒性[3-4]，子宮內暴露DEHP可縮短雄性肛門生殖器距離[5]，并且在嚙齒類動物模型中的實驗也證實了這些發現[6]。

我們前期研究發現，DEHP暴露致青春期Wistar大鼠睪丸生精小管嚴重萎縮，各級生精細胞減少；黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、睪酮(testosterone，T)、促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone，FSH)水平顯著上升[7]。本實驗通過檢測DEHP對小鼠精原細胞Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平的影響，進一步探討DEHP對雄性生殖系統功能影響的毒作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細胞株

小鼠精原細胞(GC-1spd)，由北京協和基礎研究所分子生物學實驗室惠贈。

1.2 儀器與試劑

酶標儀(MK3, Thermo公司，USA)，流式細胞儀(FACSCalibur, BD公司，USA)，PCR擴增儀(BIO-RAD, USA)，電泳儀(DYY-8C，北京六一醫學儀器廠)，紅外激光成像系統(Odyssey CLx, USA)。

DEHP(化學純，純度>99%，國藥集團化學試劑有限公司)，DMEM高糖培養基(gibco公司)，胎牛血清(gibco公司)，胰蛋白酶(gibco公司)，MTT(Amresco公司)，凋亡試劑盒(BD公司)，PCR試劑盒(上海生物工程有限公司)，Anti-Bax抗體(艾博抗上海貿易有限公司)，Anti-Bcl-2抗體(艾博抗上海貿易有限公司)，其余試劑均為市售分析純。

1.3 細胞培養及DEHP溶液配制

將小鼠精原細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞密度達70%～80%，用0.25%胰酶消化，1 000 r·min-1離心5 min后傳代。

DEHP溶液配制：取原濃度為106mg·L-1的DEHP溶液100 μL，加入900 μL完全培養基，制成濃度為105mg·L-1的DEHP溶液，根據濃度梯度計算原則，依次配制1 000、100、10 mg·L-1的DEHP溶液。對照組為完全培養基。

1.4 MTT法檢測細胞相對活力

將對數生長期小鼠精原細胞經胰蛋白酶消化后配制成密度為2×104cells·mL-1的細胞懸液，以每孔200 μL細胞懸液接種于96 孔培養板中培養24 h。換成DEHP終濃度為0、10、100、1 000 mg·L-1的培養液培養24 h后。細胞處理并每孔加入20 μL的5 mg·mL-1MTT溶液，繼續孵育4 h，吸掉培養基，再加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶聯儀于490 nm處檢測各孔吸光度值(OD)，實驗重復3 次，計算其平均值，并按公式計算細胞相對活力。每個濃度設3個復孔。細胞相對活力=(OD染毒組/OD對照組)×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

小鼠精原細胞經DEHP染毒24 h后，用0.25%胰酶消化并收集細胞，離心棄上清，加入1×binding buffer 1 mL，再離心棄上清液，用1×binding buffer 100 μL反復吹打細胞至單細胞懸液，調整濃度為1×106cells·mL-1。取細胞懸液100 μL至新的1.5 mL離心管，加入Annexin V-FITC和PI的混合液10 μL，輕彈混勻，室溫避光孵育15 min。轉移至新的流式玻璃管中，加入1×binding buffer 400 μL，輕彈混勻。在流式細胞儀上進行檢測。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測Bax和Bcl-2 mRNA表達

細胞總RNA提取與cDNA合成按試劑盒說明書進行。cDNA產物置-20 ℃保存。采用BIO-RAD型PCR儀，以GAPDH為內參照進行PCR。Bax基因引物序列，上游：5＇-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3＇，下游：5＇-CGTGTCCACGTCAGCAATCA-3＇；Bcl-2引物序列，上游：5＇-TGAAGCGGTCCGGTGGATA-3＇，下游：5＇-CAGCATTTGCAGAAGTCCTGTGA-3＇；Gapdh引物序列，上游：5＇-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3＇，下游：5＇-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3＇。反應條件，95 ℃、 30 s，95 ℃、 3 s，60 ℃、 30 s，共40個循環。計算目的基因Bax和Bcl-2的相對表達量(relative quantification，RQ)。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測Bax和Bcl-2蛋白表達

收集細胞，用裂解液提取細胞總蛋白，依據BCA法進行蛋白定量，蛋白上樣量為50 μg，將電泳后分離的蛋白電轉至NC膜上，5%的脫脂奶粉封閉，分別加Bax或Bcl-2兔抗鼠抗體，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次15 min。再加入鼠抗兔IgG抗體。室溫反應1 h，TBST洗2次，TBS洗1次，每次10 min，以Tubulin作為內參照，以紅外激光成像系統掃描并分析圖像，再計算相對表達量。

1.8 統計學方法

2 結果(Results)

2.1 DEHP對細胞相對活力的影響

采用MTT比色法檢測不同濃度(0、10、100和1 000 mg·L-1)DEHP作用于小鼠精原細胞24 h后的細胞相對活力(圖1)。結果顯示(F=1 346.806，P=0.000)隨著DEHP暴露濃度增加，細胞相對活力呈下降趨勢，分別為100%、97.3%、77.9%和62.8%。其中1 000 mg·L-1劑量組明顯低于其他各劑量組，100 mg·L-1劑量組低于對照組和10 mg·L-1劑量組(P<0.05)。

圖1 DEHP對小鼠精原細胞相對活力變化注：*與對照組比較，P <0.05；◆與10 mg·L-1比較，P <0.05；?與100 mg·L-1比較，P <0.05。Fig. 1 Effect of DEHP on the relative activity of mouse spermatogoniaNote: *P <0.05 vs control group; ◆P <0.05 vs 10 mg·L-1; P<0.05 vs 100 mg·L-1.

2.2 DEHP對小鼠精原細胞的凋亡作用

如圖2、表1所示，小鼠精原細胞經DEHP染毒24 h后，早期凋亡率1 000 mg·L-1劑量組高于對照組(P<0.05)；晚期凋亡率1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組均明顯高于對照組，1 000 mg·L-1劑量組高于10 mg·L-1劑量組(P<0.05)；總凋亡率呈現明顯上升趨勢，其中1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯高于對照組，1 000 mg·L-1劑量組還明顯高于10 mg·L-1劑量組(P<0.05)。

2.3 DEHP對小鼠精原細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達水平的影響

小鼠精原細胞Bax和Bcl-2 mRNA實時熒光定量PCR檢測結果見表2。Bax mRNA表達水平1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯高于對照組，1 000 mg·L-1劑量組與10 mg·L-1劑量組比較差異具有統計學意義(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表達水平1 000 mg·L-1劑量組低于10 mg·L-1劑量組和對照組(P<0.05)；此外，Bax和Bcl-2 mRNA比值1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組均明顯高于對照組，1 000 mg·L-1劑量組高于10 mg·L-1劑量組(P<0.05)。

2.4 DEHP對小鼠精原細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2表達水平的影響

表3、圖3所示，在內參表達一致的情況下，小鼠精原細胞經不同濃度DEHP作用24 h后，Bax蛋白表達水平1 000 mg·L-1劑量組高于對照組(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達水平各劑量組與對照組比較差異均具有統計學意義，且1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯低于10 mg·L-1劑量組和對照組(P<0.05)；此外，Bax/Bcl-2兩蛋白間的比值關系是決定細胞凋亡的關鍵因素，1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯高于對照組，而1 000 mg·L-1劑量組高于10 mg·L-1劑量組(P<0.05)，隨著DEHP染毒劑量的增加，Bax/Bcl-2比值呈現上升趨勢。

表1 小鼠精原細胞凋亡率檢測結果Table 1 The apoptosis of mouse spermatogonia (±s)

注：*與對照組比較，P<0.05；◆與10 mg·L-1比較，P<0.05。

Note：*P<0.05 vs control group；◆P<0.05 vs 10 mg·L-1.

表2 小鼠精原細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達檢測結果Table 2 The Bax and Bcl-2 mRNA expression of the mouse spermatogonia (%) (±s)

注：*與對照組比較，P<0.05；◆與10 mg·L-1比較，P<0.05。

Note：*P<0.05 vs control group;◆P<0.05 vs 10 mg·L-1.

圖2 流式細胞儀檢測小鼠精原細胞凋亡注：O, 對照組；A, DEHP低劑量組；B, DEHP中劑量組；C, DEHP高劑量組。Fig. 2 The apoptosis of the mouse spermatogonia detected by flow cytometryNote: A, control; B, low-dose DEHP; C, medium-dose DEHP; D, high-dose DEHP.

圖3 小鼠精原細胞Bax和Bcl-2蛋白Western印記檢測注: O, 對照組；A, DEHP低劑量組；B, DEHP中劑量組；C, DEHP高劑量組。Fig. 3 Analysis of Bax and Bcl-2 protein expressions in the mouse spermatogonia detected by Western blotNote: O, control; A, low-dose DEHP; B, medium-dose DEHP; C, high-dose DEHP.

表3 DEHP染毒小鼠精原細胞24 h時Bax和Bcl-2 蛋白表達檢測結果(x±s)Table 3 The Bax and Bcl-2 protein expression of the mouse spermatogonia after 24 h exposure (x±s)

注：*與對照組比較，P<0.05；◆與10 mg·L-1比較，P<0.05。

Note：*P<0.05 vs control group;◆P<0.05 vs 10 mg·L-1.

3 討論(Discussion)

DEHP對人類和動物體的多種器官造成損傷作用，如影響肝臟、腎臟以及神經系統，還可以降低機體的免疫功能，損害生殖腺，導致生殖器官畸形甚至癌變[8]。現階段人們對DEHP的研究主要集中在生殖系統的體內研究上，而對DEHP在生殖細胞上的研究較少，尤其對精原細胞的研究。為此本文探究了DEHP對小鼠精原細胞培養過程中的影響及毒性作用機制。

精原細胞在雄性生殖細胞早期發育階段具有無限分裂的能力，能在分裂過程中保持原有的基因性狀。再者，精子發生作為維持男性生育力高度復雜和關鍵的過程，又需要精原干細胞的連續自我更新和分化以及許多分子及途徑的參與才能進行[9]，因此對精原細胞的研究是十分重要的。有研究認為DEHP可直接損害精原細胞，減少細胞數量，抑制細胞增殖，促進細胞死亡，發生性激素分泌紊亂，進而降低雄激素水平，誘導細胞凋亡[10]。

有關DEHP的濃度選擇，經過充分的預實驗證明，本實驗所選擇的暴露濃度具有實際意義。由于精原細胞對DEHP的接受程度和人體不一樣，且DEHP對精原細胞的染毒劑量目前在研究領域沒有明確規定，所以本實驗所選擇的實驗濃度對精原細胞是可行的。

本研究發現，DEHP對小鼠精原細胞有明顯的生長抑制作用，隨著DEHP暴露劑量的增加，小鼠精原細胞的細胞相對活力1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組與對照組比較有顯著差異，主要表現在增殖現象明顯減少，小鼠精原細胞形成不明顯或形成后有明顯的細胞死亡和退化現象。特別是在1 000 mg·L-1劑量組的作用下，細胞數明顯減少。相比而言10 mg·L-1劑量組對小鼠精原細胞的影響較小，可繼續增殖，但出現不同程度的細胞退化和死亡現象。總的來說，1 000 mg·L-1劑量組對細胞的影響較大，并隨著暴露時間的延長細胞損傷程度越明顯。楊電明[11]在對神經干細胞和骨髓干細胞的研究中也得出了和本文相一致的結論。Piche等[12]通過研究小鼠間質腫瘤細胞系MA-10細胞的抗雄激素潛能時也發現，DEHP可降低細胞活力，抑制細胞增殖。還有研究發現：DEHP及其代謝產物MEHP可通過抑制PI3K/AKT細胞通路和阻礙信號傳導途徑影響精原細胞的增殖[13]。

誘導細胞凋亡可能是導致精原細胞數量減少的重要因素，精原細胞數量減少，勢必會阻礙精子的發生。有研究發現，高劑量(1 500 mg·kg-1)組DEHP可使青春期SD雄性大鼠睪丸生精小管嚴重萎縮，各級生精細胞大量喪失，支持細胞呈空泡狀，間質細胞發生異常增生的現象，說明DEHP也可通過睪丸內支持細胞、間質細胞及各級生精細胞產生雄性生殖毒性作用[14]。本研究流式細胞儀分析結果表明，隨著DEHP染毒劑量的增加，各劑量組小鼠精原細胞早期、晚期及總凋亡率呈逐漸上升趨勢，尤其是1 000 mg·L-1劑量組與對照組相比，凋亡率明顯升高(P<0.05)，說明1 000 mg·L-1劑量組對小鼠精原細胞的損傷最明顯。同時也說明DEHP能夠誘導小鼠精原細胞凋亡的發生。宋曉峰等[15]發現，DEHP能誘導小鼠胚胎睪丸間質細胞凋亡，DEHP暴露組凋亡指數及凋亡細胞比例與對照組相比均有顯著差異(P<0.05)。還有研究發現，DEHP作用于青春期小鼠，可誘導其精子數量減少及生精上皮的組織學異常和減數分裂后生殖細胞的凋亡[16]。

細胞凋亡是由各種生理和病理刺激所引發的一種細胞死亡的獨特形式，且在機體生長發育和生殖衰老過程中發揮著重要的作用。導致細胞凋亡的2個主要途徑之一是線粒體途徑，在該途徑活化期間特征性的生化變化是細胞色素C滲漏到細胞質中[17]，這種從線粒體釋放的細胞色素C是由Bcl-2蛋白家族的成員調節，其中Bax和Bcl-2作為Bcl-2家族中的重要成員在細胞凋亡調控過程中發揮著重要的作用[18]。

從實時熒光定量PCR結果可以看出，Bax mRNA的表達水平在DEHP染毒24 h后，1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組明顯高于對照組，說明DEHP暴露能促使Bax mRNA 表達水平升高。相反Bcl-2 mRNA的表達水平在DEHP暴露24 h后，1 000 mg·L-1劑量組明顯低于對照組和10 mg·L-1劑量組(P<0.05)；同時，Bax和Bcl-2 mRNA比值顯示，1 000 mg·L-1劑量組與對照組比較明顯上升(P<0.05)，表明DEHP對小鼠精原細胞的損傷具有一定的劑量依賴性，并隨著染毒劑量的增加Bax基因表達增強，Bcl-2基因表達減弱，從而誘導生殖細胞凋亡。吳維光等[19-20]得出DEHP對大鼠睪丸間質細胞和支持細胞都具有毒性作用，且誘導凋亡機制與本文相同。有研究證明：低濃度的MEHP誘導Bax表達升高和促進細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，同時在轉錄和蛋白質翻譯水平降低Bcl-2的表達[21]。

細胞內Bax和Bcl-2蛋白表達的增加與減少是調控細胞凋亡的重要途徑。本研究顯示：DEHP暴露24 h后，隨著染毒劑量的增加，1 000 mg·L-1劑量組較對照組Bax蛋白表達有大幅升高趨勢，而1 000 mg·L-1和100 mg·L-1劑量組與對照組和10 mg·L-1劑量組比較Bcl-2蛋白表達水平均有降低的趨勢(P<0.05)，與Bax/Bcl-2蛋白比值中得出的結論一致，說明隨著DEHP染毒劑量的增加，Bax蛋白表達逐漸增強，Bcl-2蛋白表達逐漸減弱。可見細胞凋亡確實受Bcl-2蛋白的調節，而且Bax/Bcl-2蛋白比值在細胞凋亡過程中也發揮著至關重要的作用。Furuchi等[22]研究了轉基因小鼠精原細胞中Bcl-2蛋白的異常表達，證實小鼠精原細胞的凋亡是受Bcl-2蛋白的調節，與本文研究結論一致。

本實驗研究顯示，DEHP各劑量暴露組普遍引起小鼠精原細胞的損傷，且以高劑量組變化最為顯著，主要表現為細胞存活率顯著下降，細胞凋亡率顯著增加，進而引起精子形成障礙等一系列生殖異常表現。而DEHP暴露后致使小鼠精原細胞內Bax mRNA基因和促凋亡蛋白Bax蛋白表達上升，而Bcl-2 mRNA基因和抗凋亡Bcl-2蛋白表達下降，改變了Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比值與平衡，是決定細胞凋亡的關鍵因素和主要機制。

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