復方阿苯達唑/伊維菌素及其單藥的體內外致突變性研究

鄧林，龔玲，楊家書，賴詩韻，陳陽，林居純

四川農業大學動物醫學院, 成都 611130

復方阿苯達唑/伊維菌素作為生豬養殖上常用的寄生蟲病防治藥物，具有良好的藥效，能驅殺大部分的線蟲、絳蟲及節肢動物，其主要成分為阿苯達唑和伊維菌素。其中，伊維菌素主要對各種線蟲和節肢動物具有良好的驅殺作用[1]，而阿苯達唑則主要對線蟲和絳蟲等具有明顯的驅殺作用[2]。相關的毒理學研究顯示，伊維菌素通過與哺乳動物中樞神經系統中的門控氯離子通道結合增加γ-氨基丁酸的釋放，從而產生中樞毒性[3-4]。而阿苯達唑則能與細胞中的微球蛋白結合阻斷微絲的形成，或者干擾糖原的合成[5-6]。Gao等[7]發現土壤中殘留的阿苯達唑及其代謝產物能影響生態環境中的哨兵動物——蚯蚓的繁殖，表明其具有一定程度的環境危害。目前，關于復方阿苯達唑/伊維菌素的毒理學研究較少。為了解阿苯達唑和伊維菌素組成復方后致突變性的變化情況，同時也為獸醫臨床使用和環境危害評估提供參考。通過Ames試驗、小鼠骨髓微核試驗、小鼠精子畸變試驗對復方阿苯達唑/伊維菌素及其單藥進行了體內外的致突變性研究。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試系統

健康昆明種小鼠，SPF級，購自成都達碩生物科技有限公司，動物合格號：0016916。組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102，由中國農業大學國家新獸藥安全評價中心惠贈。

1.2 受試藥物

伊維菌素，純度≥95.4%，批號：CN01315；阿苯達唑，純度≥99.0%，批號：140928，以上藥物由拜耳(四川)動物保健有限公司惠贈。復方阿苯達唑/伊維菌素按拜耳(四川)動物保健有限公司提供配方制備，其中阿苯達唑和伊維菌素比例為24:1。用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將阿苯達唑和伊維菌素按比例配成不同濃度的復方阿苯達唑/伊維菌素混懸液備用。

1.3 試劑

敵克松，純度>98%，購自Sigma-Aldrich上海(貿易)有限公司；二氨基芴，純度>98%，購自Sigma-Aldrich上海(貿易)有限公司；1,8-二羥基蒽醌，純度>96%，購自Sigma-Aldrich上海(貿易)有限公司；疊氮鈉，純度>99.5%，購自博大泰克生物技術有限公司；注射用環磷酰胺，購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；二甲亞砜，分析純，購自西隴化工股份有限公司；甲醇，分析純，購自西隴化工股份有限公司；滅活小牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉，分析純，購自成都市科龍化工試劑廠；吉姆薩染色液和2%伊紅染液為自配。S9為本實驗室通過多氯聯苯(PCB)誘導大鼠獲得的肝臟勻漿上清液，且經鑒定合格[8]。

1.4 Ames試驗

采用組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌的TA97、TA98、TA100、TA102作為本次試驗的檢測菌株。根據預實驗結果，用二甲亞砜分別溶解伊維菌素、阿苯達唑和復方阿苯達唑/伊維菌素并配制成50.00 mg·mL-1的溶液。以該濃度為最高濃度，將3種受試藥物溶液分別按5倍比例稀釋成10.00 mg·mL-1、2.00 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1系列濃度，溶劑對照組為二甲亞砜，不加S9的TA97、TA98、TA102的標準陽性對照為敵克松(每個培養皿中50.00 μg)、不加S9的TA100標準陽性對照為疊氮鈉(每個培養皿中1.50 μg)、加S9的TA97、TA98、TA100的標準陽性對照為二氨基芴(每個培養皿中10.00 μg)，加S9的TA102的標準陽性對照為1,8-二羥基蒽醌(每個培養皿中50.00 μg)。另設空白對照以觀察自發回變菌落數。分別取0.1 mL增菌液和受試藥物加入2 mL頂層培養基中混勻后，倒入底層培養基并均勻覆蓋。于37 ℃生化培養箱中經過48 h培養后，計數每皿回變菌落數。試驗將在含有S9不含S9 這2種不同代謝活化條件下進行，每個劑量3個平行[8]。

1.5 骨髓細胞微核試驗

70只體重在18～22 g的健康昆明小鼠按體重隨機分為7組，每組10只，雌雄各半。根據先前急性毒性試驗結果(半數致死量，LD50=1 501.18 mg·kg-1)設復方阿苯達唑/伊維菌素組高、中、低劑量分別為360.28/15.01 mg·kg-1(1/4LD50)，180.14/7.51 mg·kg-1(1/8LD50)和90.07/3.75 mg·kg-1(1/16LD50)，并以高劑量組各成分對應的劑量分別作為伊維菌素單藥組(15.01 mg·kg-1)和阿苯達唑單藥組(360.28 mg·kg-1)的劑量，以比較單藥與復方的毒性差異。用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液將藥物制備成混懸液。另設陰性對照組(0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液)和環磷酰胺(CP)陽性對照(40.00 mg·kg-1)。

表1 復方阿苯達唑/伊維菌素Ames試驗各組菌落計數Table 1 The bacteria counting of compound albendazole and ivermectin groups in Ames test (±SD)

注： “/”表示不加S9的TA97、TA98、TA102，其標準陽性對照敵克松劑量為50.00 μg·皿-1；不加S9的TA100，其標準陽性對照疊氮鈉劑量為1.50 μg·皿-1；加S9的TA97、TA98、TA100，其標準陽性對照二氨基芴的劑量為10.00 μg·皿-1；加S9的TA102，其標準陽性對照1,8-二羥基蒽醌的劑量為50.00 μg·皿-1。

Note： “/” in the table indicated Dexon, the positive control of TA97, TA98 and TA102 without S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1; NaN3, the positive control of TA100 without S9, added into the plate was 1.50 μg·plate-1; 2-Aminofluorene, the positive control of TA97, TA98 and TA100 with S9, added into the plate was 10.00 μg·plate-1; 1,8-Dihydroxyanthraquinone, the positive control of TA102 with S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1.

表2 伊維菌素Ames試驗各組菌落計數Table 2 The bacteria counting of ivermectin groups in Ames test (±SD)

注： “/”表示不加S9的TA97、TA98、TA102，其標準陽性對照敵克松劑量為50.00 μg·皿-1；不加S9的TA100，其標準陽性對照疊氮鈉劑量為1.50 μg·皿-1；加S9的TA97、TA98、TA100，其標準陽性對照二氨基芴的劑量為10.00 μg·皿-1；加S9的TA102，其標準陽性對照1,8-二羥基蒽醌的劑量為50.00 μg·皿-1。

Note： “/” in the table indicated Dexon, the positive control of TA97, TA98 and TA102 without S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1; NaN3, the positive control of TA100 without S9, added into the plate was 1.50 μg·plate-1; 2-Aminofluorene, the positive control of TA97, TA98 and TA100 with S9, added into the plate was 10.00 μg·plate-1; 1,8-Dihydroxyanthraquinone, the positive control of TA102 with S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1.

表3 阿苯達唑Ames試驗各組菌落計數Table 3 The bacteria counting of albendazole groups in Ames test (±SD)

注：“/”表示不加S9的TA97、TA98、TA102，其標準陽性對照敵克松劑量為50.00 μg·皿-1；不加S9的TA100，其標準陽性對照疊氮鈉劑量為1.50 μg·皿-1；加S9的TA97、TA98、TA100，其標準陽性對照二氨基芴的劑量為10.00 μg·皿-1；加S9的TA102，其標準陽性對照1,8-二羥基蒽醌的劑量為50.00 μg·皿-1。

Note： “/” in the table indicated Dexon, the positive control of TA97, TA98 and TA102 without S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1; NaN3, the positive control of TA100 without S9, added into the plate was 1.50 μg·plate-1; 2-Aminofluorene, the positive control of TA97, TA98 and TA100 with S9, added into the plate was 10.00 μg·plate-1; 1,8-Dihydroxyanthraquinone, the positive control of TA102 with S9, added into the plate was 50.00 μg·plate-1.

表4 復方阿苯達唑/伊維菌素及其單藥對小鼠骨髓微核率的影響(n=10)Table 4 The effect of the combination and its components of albendazole and ivermectin on micronucleus rate in mice (n=10)

注： “*”表示與陰性對照組比較，差異顯著(0.01

Note： “*” indicated significant difference (0.01

各組均采用經口灌胃染毒，灌胃容積為0.2 mL·(10 g)-1。采用30 h染毒法，于末次染毒后6 h處死小鼠。取小鼠股骨，去除兩端骨骺，用小牛血清反復吹洗骨髓于玻片上，常規涂片并自然干燥后經甲醇固定，吉姆薩染色，油鏡下計數嗜多染紅細胞微核率、嗜多染紅細胞與正染紅細胞比值(PCE/NCE)[9,11]。

1.6 小鼠精子畸變試驗

35只體重在25～30 g的健康雄性昆明小鼠按體重隨機分為7組，每組5只。給藥組(復方阿苯達唑/伊維菌素、伊維菌素、阿苯達唑)、陰性對照組的劑量設置與給藥途徑同小鼠骨髓微核試驗，給藥頻率為每日1次，連續給藥5 d。CP陽性對照腹腔注射一次，劑量為50.00 mg·kg-1。在首次染毒后第35天處死小鼠，取兩側附睪制成涂片，經甲醇固定后，伊紅染色，光鏡下計數精子總數及各類畸形精子數。每只小鼠檢查1 000個精子，計算精子畸形率及畸形類型構成比[10-11]。

1.7 數據統計分析及結果判定

Ames試驗中，如在背景菌苔生長良好條件下，受試回變菌落數增加一倍以上，并有劑量反應關系或至少某一測試點超過對照2倍以上有可重復的并有統計學意義的陽性反應，即可認為該受試物為誘變陽性[8]。

微核試驗和精子畸變試驗的數據使用SAS 9.0軟件FREQ程序對給藥各組與陰性對照組微核率和精子畸變率進行差異性分析和趨勢檢驗。對微核試驗中的PCE/NCE比值進行t檢驗。PCE/NCE大于或等于1，說明受試物對骨髓細胞沒有毒性，反之則有毒性；PCE/NCE小于0.05則結果不可信[9-10]。

2 結果(Results)

2.1 Ames試驗結果

對培養48 h的平板進行觀察，發現所有平板上均可見生長良好的背景菌苔，在加S9和不加S9條件下，復方阿苯達唑/伊維菌素及其單藥組任何濃度中均未發現回復突變菌落數超過陰性對照組2倍以上，同時，每株菌在加S9和不加S9的情況下也并未表現出明顯的量效關系。以上表明，復方阿苯達唑/伊維菌素及其單藥對TA97、TA98、TA100、TA102菌株均無誘發突變作用(見表1，表2)。

2.2 骨髓細胞微核試驗結果

小鼠骨髓微核試驗結果表明，CP陽性對照組微核率明顯高于陰性對照組(P≤0.01)，顯示陽性結果，PCE/NCE >0.05表明實驗結果可靠。復方組3個劑量下均引起嗜多染紅細胞微核率的升高，但只有高、中劑量組與陰性對照組具有統計學差異(P≤0.01)。伊維菌素和阿苯達唑單藥組均明顯提高了微核率(P≤0.01)，但僅有阿苯達唑單藥組的微核率明顯高于相對應的復方高劑量組(P≤0.01)。陰性對照組和陽性對照組PCE/NCE均大于1，復方各組及兩單藥組PCE/NCE均小于1，并明顯低于陰性對照組，說明了伊維菌素、阿苯達唑及其復方均對骨髓細胞有一定抑制作用(見表3，表4)。

表5 復方阿苯達唑/伊維菌素及其單藥對小鼠精子畸形率的影響(n=5)Table 5 The effects of the combination and its components of albendazole and ivermectin on the sperm abnormalities of mice (n=5)

注：“*”表示與陰性對照組比較，差異顯著(0.01

Note： “*” indicated significant difference (0.01

2.3 小鼠精子畸變試驗

復方阿苯達唑/伊維菌素致小鼠精子畸變試驗結果見表5、6。由表5可見，CP陽性對照組精子畸形率明顯高于陰性對照，表明實驗結果可靠。復方各組小鼠精子畸形率逐漸升高，其中高、中劑量組精子畸形率明顯高于陰性對照組(P≤0.01)有量效關系。兩單藥組的精子畸形率也明顯高于陰性對照組(P≤0.01)，在單藥組和復方組的比較中也發現，伊維菌素單藥組(0.01

3 討論(Discussion)

Ames試驗是一種經典的體外遺傳毒性評價方法，并以出現基因突變為試驗終點,常用于檢測受試物是否具有致基因出現點突變能力[12]。已有的研究顯示，伊維菌素和阿苯達唑沒有致突變作用[6,13]。本次研究結果表明，在加與不加S9條件下，伊維菌素和阿苯達唑對TA97、TA98、TA100、TA102菌株均無誘發突變作用，與已有報道一致。而由二者按1:24形成的固定劑量復方也表現出與單藥一致的致突變陰性，表明伊維菌素與阿苯達唑在此比例下形成的復方其誘變性未發生改變。

微核是存在于胞漿中獨立的核小體，它是由染色體斷裂產生無著絲粒的斷片或由于紡錘絲斷裂造成一條或一組染色體滯留在胞質中而形成，可由外界因素誘導或自發性產生[14]。小鼠骨髓微核試驗結果表明，復方組總劑量高于187.65 mg·kg-1時能明顯提高小鼠骨髓嗜多染紅細胞的微核率，且各劑量組PCE/NCE比值均小于1，表明復方阿苯達唑/伊維菌素對骨髓細胞有抑制作用。伊維菌素單藥組和阿苯達唑單藥組均明顯提高了微核率，與Ermler等[15]和Ashmawy等[16]的報道相一致。阿苯達唑作為一種已知的紡錘體抑制劑，其作用靶標為紡錘絲[17]，顯然能造成微核的形成。體外試驗發現伊維菌素能造成單股DNA斷裂[18]。因此，推測復方阿苯達唑/伊維菌素可能從紡錘體和DNA兩方面產生致突變作用，從而增強毒性。然而，對比復方組和單藥組的微核率發現，阿苯達唑單藥組的微核率明顯高于復方組，而伊維菌素單藥組的微核率與復方組之間無統計學差異，可見復方阿苯達唑/伊維菌素不但沒出現毒性增強，相較于單藥其毒性反而下降。

表6 復方阿苯達唑/伊維菌素及其單藥對小鼠精子畸形類型構成的影響(n=5)Table 6 The effects of the combination and its components of albendazole and ivermectin on the sperm abnormality types of mice (n=5)

小鼠精子致畸試驗結果顯示，復方組總劑量高于187.65 mg·kg-1時精子畸形率明顯高于陰性對照組(P≤0.01)，且具有明顯的量效關系，說明復方阿苯達唑/伊維菌素對小鼠雄性生殖細胞具有致突變性。然而，在Otubanjo和Mosuro[19-20]等進行的阿苯達唑精子致畸試驗中并未觀察到陽性結果，同時在他們進行的伊維菌素的精子致畸試驗中僅觀察到精子畸形率的輕度增高，但并未明顯高于陰性對照且無劑量相關性。本次研究中，阿苯達唑和伊維菌素的劑量均高于Otubanjo和Mosuro的研究劑量，說明了在高劑量情況下，阿苯達唑和伊維菌素均能對小鼠雄性生殖細胞產生毒性。從復方和單藥精子畸形率差異可知，復方誘導的小鼠精子畸形率明顯低于兩單藥組。由此可見，復方毒性相較于單藥有所降低，同時畸形種類分布上也有較大差異，其機制有待進一步研究。

伊維菌素和阿苯達唑按1:24的比例形成的復方在Aems試驗中表現出同單藥一樣的致突變陰性，而在小鼠骨髓微核試驗和小鼠精子畸變試驗中卻表現出較單藥更低的毒性，顯示了復方的優越性，其原因可能是伊維菌素和阿苯達唑在藥動學上的相互作用，并且已有大量的研究表明伊維菌素和阿苯達唑聯合應用會導致各自藥動學參數的改變。雖然，復方阿苯達唑/伊維菌素表現出了較單藥更低的毒性，但是，其仍然是一種能引起小鼠骨髓微核率和精子畸變率升高的致突變陽性藥物。鑒于其在農業生產上應用廣泛，需警惕該藥物的食品殘留問題及對生態環境的危害。

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