基于RAPD技術檢測不同烴鏈長度咪唑基離子液體對日本三角渦蟲的遺傳毒性

張合彩，石長應，劉童祎，劉艷方，陳廣文，劉德增

河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007

淡水渦蟲隸屬于扁形動物門(Platyhelminthes)、渦蟲綱(Turbellaria)、三腸目(Tricladida)、淡水亞目(Paludicola)，廣泛分布于世界各地潔凈的泉溪湖泊之中，是淡水生態系統的重要成員之一。由于渦蟲對環境中的毒性因子非常敏感，亞致死劑量的農藥、重金屬等都會引起其從DNA分子到個體水平的損傷改變[1-4]；此外，淡水渦蟲易于大量采集且室內飼養成本相對較低，所有這些特點使得淡水渦蟲成為毒理學研究的合適實驗動物之一。日本三角渦蟲(Dugesiajaponica)是東亞地區廣泛分布的淡水渦蟲物種，由于具有強大的再生能力及高度的化學敏感性，已逐漸成為再生藥物、干細胞、神經疾病及毒理學研究的模式生物[5]。

離子液體(Ionic Liquids，ILs)是一類完全由離子構成，在室溫或較低溫度(<100 ℃)下呈液態的鹽，也稱為室溫離子液體或低溫熔融鹽[6]。因其具有不揮發、不易燃、電導率高、蒸氣壓小、性質穩定、溶解性好、可設計性強等優良特性而在諸多工業領域廣泛應用。但是隨著研究的深入及應用范圍的擴大，人們逐漸對離子液體的綠色性產生質疑，對其生物毒性及環境風險評價的相關研究屢見報道。由N，N -二烷基咪唑陽離子與陰離子構成的咪唑類離子液體具有易于制備、結構易于調控等優點，是目前應用和研究較多的離子液體[7]。關于離子液體對水藻[8]、浮萍[9]、大型蚤[10]、河蚌[11]以及斑馬魚[12]等水生生物的毒性測試已見諸報道，其中也有研究表明離子液體生物毒性的大小隨其烴鏈長度的增加而增強。但是，迄今為止離子液體對淡水渦蟲的毒性研究卻鮮見報道。

彗星分析及染色體畸變曾被用于檢測環境中有毒物質對渦蟲的遺傳毒性效應[1,13]。隨著分子生物學的飛速發展，在遺傳毒理學領域又出現了許多基于PCR技術的DNA分析方法。隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)就是其中之一，該技術基于PCR，能從DNA 分子水平直接反映整個基因組的特征，快速、準確地檢測基因組DNA因發生片段的插入、缺失或堿基的突變而產生的多態性信息[14]。RAPD技術最早用于遺傳作圖、分類及系統發育的多態性檢測，后來又被用于遺傳毒性及致癌作用分析[15]。目前，RAPD技術已成功用于污染物對動物、植物、微生物及體外培養細胞系的遺傳毒性檢測[16-20]。本文利用RAPD技術檢測4種不同烴鏈長度的咪唑基離子液體對日本三角渦蟲的遺傳毒性，旨在考察咪唑基離子液體側鏈長度與其遺傳毒性大小的關系，從而為闡釋離子液體的毒性機制奠定基礎，同時也為離子液體環境風險評價和科學管理積累資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 離子液體

實驗用4種咪唑類離子液體溴化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Br)、溴化1-己基-3-甲基咪唑([C6mim]Br)、溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br)、溴化1-癸基-3-甲基咪唑([C10mim]Br)均購自湖北恒碩化工有限公司(武漢)(圖1)，純度大于99%，其中[C4mim]Br為白色晶體，其余均為淡黃色粘稠液體。實驗前先用雙蒸水分別配成2 000、1 500、1 000和100 mg·L-1的母液，密封保存于4 ℃冰箱內，實驗時再根據需要稀釋到相應濃度待用。

圖1 離子液體溴化1-烷基-3-甲基咪唑結構式示意圖注： R=C4H9: [C4mim]Br; R=C6H13: [C6mim]Br; R=C8H17: [C8mim]Br; R=C10H21: [C10mim]Br。Fig. 1 General structure of alkylmethylimidazolium-based ionic liquids (ILS)Note: R=C4H9: [C4mim]Br; R=C6H13: [C6mim]Br; R=C8H17: [C8mim]Br; R=C10H21: [C10mim]Br.

1.2 供試動物

實驗用日本三角渦蟲(D.japonica)采自河南省淇縣魚泉鄉溪流中，用曝氣自來水飼養于實驗室內，每2周用新鮮的魚脾臟飼喂一次，喂食后每2天換水一次。饑餓處理一周以上的渦蟲方可用于毒理學實驗。

1.3 毒性暴露與取樣

根據石長應等[21]測定4種咪唑類離子液體對渦蟲的半致死濃度(LC50)及預實驗，分別設定其1/8LC50(即[C4mim]Br 260 mg·L-1、[C6mim]Br 115 mg·L-1、[C8mim]Br 39 mg·L-1、[C10mim]Br 4 mg·L-1)為本實驗處理濃度。隨機挑選形態正常、最大伸展體長(10±2) mm的渦蟲個體25條，平均分為5組，每組5條，置于培養皿中。將其中1組設為對照組，用曝氣自來水培養，另外4組設為處理組，分別用上述濃度的4種離子液體暴露處理。整個實驗于恒溫培養箱(20±1) ℃中進行，每24 小時更換一次處理液。在暴露處理的第3天和第5天分別從各處理組中隨機挑取1條渦蟲用于基因組DNA提取。

1.4 基因組DNA提取

渦蟲基因組DNA的提取根據Zhang和Qiao[22]對蚜蟲的提取方法稍作改動。單條渦蟲加適量STE緩沖液(30 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)勻漿，然后加適量裂解液(30 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1NaCl，1% SDS，0.5 mg·mL-1proteinase K，pH 8.0)于55 ℃消化2～4 h至澄清，再用標準的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA。所得DNA用冷乙醇沉淀，再經離心、沖洗、干燥后溶于40 μL TE緩沖液(30 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1EDTA，pH 8.0)中，殘余RNA用RNase A于37 ℃消化除去。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA分子的質量(完整性)，用NanoDrop 2000 微量分光光度計(基因公司)測定其濃度及純度(OD260/OD280)。

1.5 RAPD-PCR擴增

根據張合彩等[23]優化的渦蟲RAPD-PCR條件，對購自上海生工的20條隨機引物進行篩選，篩選出的引物用于PCR擴增。PCR反應總體系為15 μL，含20 ng基因組DNA、0.2 μmol·L-1隨機引物(上海生工)、2×Taq Master Mix(鄭州森思科貿)。擴增反應在DNA thermocycler擴增儀(Biometra公司，德國)上進行，其反應程序為：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共進行40個循環，之后終延伸5 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用GIS-1000凝膠自動成像系統(廣州方統生物科技)拍照，用圖像分析軟件Genescope1.73對擴增產物大小進行自動評估。

1.6 基因組模板穩定性計算

基因組模板穩定性(GTS)依據公式GTS (%) = (1-a/n)×100計算，此處“a”為處理組的多態性條帶數，“n”是對照組的總帶數。RAPD圖譜的多態性包括與對照組相比的新增帶和消失帶[24]。為便于比較，將對照組GTS設為100%，各處理組GTS以相對對照的百分數表示。

2 結果(Results)

2.1 基因組DNA及RAPD圖譜的可重復性

圖2 經4種不同烴鏈長度咪唑類離子液體暴露3 d和5 d時的渦蟲基因組DNA注：0, 對照組；4C, [C4mim]Br；6C, [C6mim]Br；8C, [C8mim]Br；10C, [C10mim]Br；M, DNA分子量標準(自上而下分別為10 000、7 000、4 000、2 000、1 000、500、250 bp)。Fig. 2 The quality of DNA isolated from Dugesia japonica exposed to imidazolium-based ILs with different alkyl-chain lengths for 3 and 5 daysNote: 0, Control; 4C, [C4mim]Br; 6C, [C6mim]Br; 8C, [C8mim]Br; 10C, [C10mim]Br; M, DNA molecular size marker (10 000, 7 000, 4 000, 2 000, 1 000, 500, 250 bp from top to bottom).

圖3 引物S10擴增的渦蟲RAPD圖譜的可重復性注： M, DNA分子量標準(自上而下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)。Fig. 3 Reproducibility of RAPD profiles generated from planarian DNA by primer S10Note: M, DNA molecular size marker (2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp from top to bottom).

所提基因組DNA的OD260/OD280比值在1.7～2.2之間，說明各樣品的純度較高。電泳結果表明各DNA樣品均為單條帶，說明所提DNA分子完整性好，沒有降解(圖2)。引物S10對同一樣品的擴增結果表明RAPD-PCR結果穩定，具有較強的可重復性(圖3)。

2.2 4種不同烴鏈長度咪唑基離子液體對渦蟲RAPD圖譜的影響

在20條隨機引物中只有11條(表1)能擴增出穩定且多態性較高的RAPD條帶，其他9條無擴增或為彌散帶(圖4、表2)。RAPD圖譜的變化主要表現在與對照相比條帶亮度的增強或減弱以及新帶的出現和正常帶的消失。本研究中經4種不同烴鏈長度咪唑基離子液體暴露的渦蟲RAPD 圖譜與對照相比明顯不同，且隨著離子液體烴鏈長度的增加和暴露時間的延長發生明顯改變，其中新增帶(a)、消失帶(b)、亮度增加帶(c)以及亮度減弱帶(d)的總數在5 d時4種離子液體組分別為63、66、74、80條(表2)。

總體而言，處理組新增帶的條數不但與離子液體的碳鏈長度正相關而且與暴露的時間正相關(圖4、表2)。暴露3 d時，離子液體處理組渦蟲的新增帶分別為12、16、18和20條。隨著暴露時間的延長各處理組新增帶的條數增加，至暴露5 d時4個處理組的新增帶條數分別增至17、18、20和22條。

在11條引物的擴增圖譜中，離子液體處理組均有正常條帶的消失(圖4、表2)，并且消失帶的條數也與離子液體的碳鏈長度及暴露時間正相關。暴露3 d時，離子液體處理組的消失帶條數分別為14、16、17、19條。當暴露至5 d時，4個處理組渦蟲RAPD圖譜消失帶的條數分別增至16、17、19和20條。此外，處理組渦蟲RAPD圖譜中亮度增強帶和減弱帶的總數一定程度上也隨離子液體碳鏈長度的增加和暴露時間的延長而增加，即與之存在正相關關系。

2.3 基因組模板穩定性(GTS)

基因組模板穩定性(GTS)是反應處理組PCR擴增譜相對對照組改變的百分比值。對每一條引物而言，其擴增的多態性條帶隨離子液體碳鏈長度(4、6、8、10)和暴露時間(3 d、5 d)而異(表2)。我們根據篩選出來的11條引物擴增的RAPD圖譜計算出了各處理組總的GTS值(圖5)。4種不同烴鏈長度的咪唑基離子液體處理組渦蟲在暴露3 d和5 d時的GTS值分別為60%、51%、46%、40%和49%、46%、40%、35%，即對于同樣暴露時間隨著離子液體碳鏈長度的增加各處理組渦蟲基因組模板穩定性下降；而對于同一種離子液體，則隨著暴露時間的延長其GTS值降低。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this experiment

表2 4種不同烴鏈長度咪唑基離子液體處理3 d和5 d時渦蟲的RAPD圖譜多態性帶及變異帶Table 2 Polymorphic bands and varied bands in Dugesia japonica treated by 4 kinds of imidazolium-based ILs with different alkyl-chain length for 3 and 5 days

注：a, 新增帶;b, 消失帶;c, 亮度增強帶;d, 亮度減弱帶；a+b, 多態性帶;a+b+c+d, 變異帶。

Note：a, appearance of new bands;b, disappearance of normal bands;c, increase in band intensities;d, decrease in band intensities;a+b, polymorphic bands;a+b+c+d, varied bands.

圖4 引物S15、S20、S80及S84擴增的4種不同烴鏈長度咪唑基離子液體暴露3 d和5 d的渦蟲RAPD圖譜注：0, 對照；4C, [C4mim]Br；6C, [C6mim]Br；8C, [C8mim]Br；10C, [C10mim]Br；M, DNA分子量標準(自上而下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)。Fig. 4 RAPD profiles of D. japonica exposed to 4 kinds of imidazolium-based ILs with different alkyl-chain lengths for 3 and 5 days with primers S15, S20, S80 and S84Note: 0, Control; 4C, [C4mim]Br; 6C, [C6mim]Br; 8C, [C8mim]Br; 10C, [C10mim]Br; M, DNA molecular size marker (2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp from top to bottom).

圖5 渦蟲經4種不同烴鏈長度咪唑基離子液體暴露3 d和5 d的基因組模板穩定性Fig. 5 Genomic DNA template stability (GTS) of D. japonica exposed to 4 kinds of imidazolium-based ILs with different alkyl-chain lengths for 3 and 5 days

3 討論(Discussion)

RAPD技術在出現伊始常常被用于遺傳作圖、分類及系統發育研究，后來該技術在檢測DNA突變等方面也有應用。由于該技術具有快速、無放射性，適于檢測任何生物的DNA損傷以及突變和重排等優點，目前已在多種生物中用于檢測不同類型污染物的遺傳毒性[16-20]。

本研究利用RAPD技術檢測了4種不同烴鏈長度的咪唑基離子液體對日本三角渦蟲的遺傳毒性，結果表明離子液體處理組渦蟲的RAPD圖譜和對照組明顯不同，主要表現在條帶亮度的變化以及正常帶的消失和新增帶的出現。文獻報道生物體在離子液體脅迫下其體內的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會增加[25-26]。生物體內由ROS引起的DNA損傷包括鏈斷裂、堿基改變以及無堿基位點[27]。除了ROS攻擊，由于DNA加合物的不完全剪切修復，DNA鏈的斷裂和錯配也常常發生。處理組引物結合位點DNA的損傷或突變將會導致與無損傷對照相比DNA指紋的變化。本研究中RAPD圖譜的變化包括條帶亮度的變化以及正常帶的消失和新增帶的出現。正常條帶的消失可能與基因毒性劑誘導的DNA損傷、點突變以及染色體重排等事件有關[28]。處理組RAPD圖譜中也檢測到了新PCR產物(新條帶)的出現。新擴增產物的出現可能是由于突變、大的缺失以及同源重組引起的引物結合位點的改變[24]。關于條帶亮度的改變，離子液體誘導的氧化性DNA損傷以及DNA—蛋白交聯會阻礙Taq聚合酶的進程從而使某些特定RAPD條帶亮度減弱，而由于DNA改變增加了引物與DNA模板的配對活性則會使某些條帶亮度增強[29]。

本研究中，對于同一種離子液體隨暴露時間的延長其RAPD圖譜的多態性增加，即存在時間依賴性關系，這和利用RAPD技術檢測藥物8-羥基喹啉對泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)以及呋喃西林對游仆蟲(Euplotesvannus)的遺傳毒性所得結果一致[16,30]。此外，在同一暴露時間隨著離子液體碳鏈長度的增加渦蟲RAPD圖譜的多態性也增加，這說明隨著咪唑基離子液體碳鏈長度的增加，其對渦蟲DNA的損傷，即遺傳毒性增強。這和我們以前關于不同烴鏈長度咪唑基離子液體對渦蟲的急性毒性及攝食、再生的影響的研究結果相一致[21,31]。Aksakal和Esim[17]的研究已經證實基因組模板穩定性(GTS)是反應污染物誘導的RAPD圖譜改變的一個靈敏參數。本研究中各處理組的GTS值隨不同種離子液體的碳鏈長度增加及同種離子液體暴露時間的延長而降低，這說明離子液體脅迫明顯影響了渦蟲的基因組模板穩定性。

總之，本研究表明咪唑基離子液體對淡水渦蟲有明顯的遺傳毒性，且該遺傳毒性的強弱與離子液體側鏈碳原子數正相關。同時，我們的研究結果也證明RAPD分析是一種檢測環境污染物對生物DNA損傷的高度靈敏的方法。

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