二元聯合作用藻紅外測試方法
——以重金屬為例

賀棟才，李星廣，郭蔚華,*，林艷，楊鵬飛，劉晨茜

1. 四川省成都市市政工程設計研究院，成都 610023 2. 重慶大學城市建設與環境工程學院，重慶 400045

化學污染物對自然水體的污染已成為全球性的環境問題[1]。檢測各污染物的環境濃度水平、評價其毒性和環境風險一直是科學界和大眾關注的焦點[2]。在實際水環境中，往往有多種化學污染物同時存在，生物體通常暴露于混合的污染物中，它們對機體同時作用產生的生物學效應(聯合作用)與任何一種化學污染物分別單獨作用所產生的生物學效應完全不同[3]，因此，分析化學污染物之間的聯合作用是必要的。

微藻是水體中食物鏈的初級生產者，個體小，多為單細胞，對水環境污染敏感，可作為受試材料分析化學污染物間的聯合作用對自然水體的生態風險。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)對化學污染物的脅迫作用極為敏感[4]，其中滇池銅綠微囊藻生長快[5-6]、飽和密度高，是測試分析化學污染物急性毒性和聯合作用的理想受試生物材料。藻類光合作用的電子傳遞鏈被抑制時，藻類天線色素吸收的光能會產生剩余激發能[7]，剩余激發能將以紅外輻射方式向藻細胞外擴散。此外，許多化學污染物可使酶蛋白變性[8]影響藻的光合磷酸化、氧化磷酸化的能量代謝[9]。因此，化學污染物作用光合電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈所產生的熱輻射疊加后更易被儀器測試。有研究報道，Cd2+[10-11]，Hg2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+[12]，樂果[13]，莠去津[14]，敵草隆、百草枯、阿特拉津[15]等對藻光合電子傳遞有抑制作用，紅霉素、環丙沙星、磺胺甲噁唑等抗生素[16]，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[17]，硝磺草酮[18]，Ni、Zn、Al[9]等對藻光合磷酸化、氧化磷酸化有影響。藻類暴露于重金屬、農藥、有機化學藥品、抗生素等有毒物質時，能產生強于其他微生物的更強的能量變化，可以用紅外測溫儀檢測到藻類的紅外輻射變化[19-22]。

藻紅外測試法和發光細菌法屬急性毒性微生物測試法，具有靈敏、快速、簡便的特點[23-29]。相比較而言，作為受試生物材料的藻類分布廣泛、藻種豐富、藻源充足，藻種的采取、純化、擴大、培養等容易，藻種獲取成本低，測試用藻有保障，同時，紅外測溫儀價格遠低于發光細菌法所用的檢測儀，因而藻紅外技術更能滿足一般科研院所、科研團隊和基層部門對技術的需求。

建立聯合作用藻紅外測試技術極為復雜，要考慮測試條件、測試藻種、藻溫測試方法、藻響應藥品的評價方法、聯合作用評價方法[30]、聯合作用偏差f值的修正、藥液配制的標準、數據處理軟件等技術環節。在聯合作用測試[31-32]中不斷發現問題，為保證與控制測試結果的質量，已完善了測試條件，改進了藻溫的測試方法[33]，修正了f值，確立了藥液配制的參照濃度分析方法等。二元聯合作用測試是多元聯合作用分析的基礎，所建立的聯合作用藻紅外測試方法能否測試分析聯合作用、效果如何等問題仍需要實驗檢驗。化學污染物的種類繁多，實驗以種類數相對穩定的重金屬作為測試藥品，進行重金屬二元聯合作用藻紅外測試方法的驗證研究。

本文將通過藥品的參照濃度分析確定測試藥液的配制濃度，進行重金屬二元聯合作用測試，分析測試結果的多樣性、再現性、重現性，檢驗測試效果，確定二元聯合作用藻紅外測試方法的可行性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用藻為滇池銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosain Dianchi Lake in China)，藻種及其培養基配方由中國科學院武漢水生生物研究所提供。測試藥品為CuSO4·5H2O、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、AlCl3·6H2O、CrCl3·6H2O、HgSO4、Cd(NO3)3·H2O、Pb(NO3)2、ZnCl2，為國產分析純，藥液濃度為重金屬濃度(g·L-1)，藥液現測現配。儀器設備包括ST60便攜式紅外測溫儀(靈敏度0.1 ℃)，購自福祿克測試儀器(上海)公司重慶分公司；HETTICH-EBA離心機，購自球興科儀國際貿易(上海)有限公司；LRH-250A生化培養箱(靈敏度±0.2 ℃)，購自韶關市泰宏醫療器械有限公司；MOTICBA200數碼顯微鏡，購自上海中恒儀器有限公司；DR/4000U分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司。測試杯為直徑4 cm、高3 cm、厚0.1～0.2 cm的透明絕熱塑料容器。

1.2 數據分析軟件

測試藻溫處理與聯合作用分析可由軟件完成或人工完成。所用軟件有：①AITAS (Algae Infrared Toxican Analysis Software)藻紅外急性毒性分析軟件，用于分析藻對藥品濃度或樣品的響應；②AITHCAS (Algae Infrared Time and Half Concentration Analysis Software)藻紅外倍半濃度分析軟件，用于分析同藥倍半關系濃度；③AICEAS (Algae Infrared Combined Effect Analysis Software)藻紅外聯合作用分析軟件，用于分析藥品間的聯合作用類型。上述軟件AITAS、AITHCAS、AICEAS由郭蔚華、祁小明等開發。

1.2 藻溫測試方法

為了提高藻對藥液響應的評價效率，將原來的藻溫測試10遍改為9遍，因此在1.3.3中指標③的藻響應率由原來的≥60%改為≥55%。

藻溫測試在室內條件下進行，采用散射日光或人工光源采光。實驗的藻液用量為5 mL·杯-1，藻密度≥3.16×109個·L-1；測試杯加藻液前，藻液充分搖均；當培養時藻增長率≤0時，藻液不再用于實驗；測試一種藥物的聯合作用時，使用同一批培養的藻液。滴加藥液前，藥液充分搖勻。

當測試杯排放好后(圖1、圖2)，每個測試杯中加入5 mL藻液，進行加藥前測溫記錄，每杯每次連測3個藻溫。然后滴加藥液，其中，蒸餾水毒性測試時用滴液管分別滴加蒸餾水1滴(約0.05 mL)于加藥組、對照組的測試杯中，重金屬毒性測試時用滴液管分別滴加藥液、蒸餾水各1滴于加藥組、對照組的測試杯中，立即進行加藥后的測溫記錄，每次每杯連測3個藻溫。測溫時，紅外測溫儀頭部距離藻液正上方10～15 cm，指示紅色光點對準藻液面中心時測溫。每杯每次連測3個藻溫，用于計算平均值。測溫順序：從上到下，從左到右。測溫遍數：3個重復測溫完畢時即為測溫1遍。藥液滴入藻液后到藻產生響應有一個過程，藻對不同藥液的響應過程不同，加藥前測溫1遍，加藥后測溫9遍。前一遍測溫完成后接著下一遍測溫。

藻溫記錄：按照測試項目的測試杯布局方式、測溫要求制作藻溫記錄表，測溫時將藻溫記錄于表中。

1.3 藻溫處理

1.3.1 藻溫處理方法

T=(Tn1+Tn2+Tn3)/3

(1)

Tni=(Tb1+Tb2+Tb3) /3

(2)

Tbi=(T1+T2+T3) /3

(3)

其中，T為每遍測溫的處理組藻溫；Tn1、Tn2、Tn3分別為3次重復的平均藻溫；Tni為重復組的平均藻溫，i=1,2,3；Tb1、Tb2、Tb3分別為空白、對照、加藥的測試杯的平均藻溫；Tbi為每個測試杯的平均藻溫，i=1,2,3；Ti為每個測試杯連續測試的藻溫(3個藻溫)，i=1,2,3。

1.3.2 藻溫差計算方法

ΔT=∣ΔTj∣-∣ΔTd∣, ΔT>0

(4)

ΔTj=(Tj- ti-Tj-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)

(5)

ΔTd=(Td-ti-Td-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)

(6)

上式(4)、(5)、(6)分別為藻響應溫差，加藥組藻溫差和對照組藻溫差的計算方法。其中，Tj-ti為加藥后加藥組的藻溫；Tj-t0為加藥前加藥組的藻溫；Tk-ti為加藥后空白組的藻溫；Tk-t0為加藥前空白組的藻溫；Td-ti為加水后對照組的藻溫；Td-t0為加水前對照組的藻溫；j為加藥組，滴加藥液；d為對照組，滴加蒸餾水；k為空白組，不滴加藥液或蒸餾水；ti為測溫遍數，i=0，為加藥前的測溫；i=1, 2,…,9為加藥后第1, 2,…,9遍測溫。

1.3.3 藻對藥液響應的三指標評價法

當藻溫差同時滿足下面3個指標時，即為藻對藥液產生響應。

指標①—最大藻溫差比較值，即加藥后9遍測溫中，︱ΔTj-max︱>︱ΔTd-max︱。

指標③—藻響應率(ψ)≥55%，即加藥后9遍測溫中，∣ΔTj∣>∣ΔTd∣的出現次數≥5。

1.3.4 首測結果的再現性、最終測試結果的重現性

首測結果的再現性用于分析第一次測試結果的可信性，最終測試結果的重現性用于分析最終測試結果的可靠性。

首測結果的再現性=(與首測結果相同的結果數/實驗數)×100%

再現性的出現率=(具有再現性的結果數/總結果數)×100%

最終測試結果的重現性=(相同結果數/實驗數)×100%

重現性的出現率=(具有重現性的結果數/總結果數)×100%

1.3.5 聯合作用最終測試結果的確認

在3次相同測試中，具有重現性的結果即為聯合作用最終測試結果。

1.4 聯合作用的評價

1.4.1 聯合作用指數偏差法

二元聯合作用采用聯合作用指數偏差法進行評價。聯合作用指數(θ)的計算式為

(7)

其中，θ為聯合作用指數；△TABmax為A、B藥聯合時產生的藻最大響應溫差；△TA為△TABmax出現的測溫遍數時，A藥的藻響應溫差；△TB為△TABmax出現的測溫遍數時，B藥的藻響應溫差。

1.4.2 評價方法

θ> 1+f

協同作用(Synergistic effect)

1-f≤θ≤ 1+f

相加作用(Additive effect)

當θ<1-f時：

△TABmax

△TABmax>max(△TA, △TB) 獨立作用(Independent effect)

1.4.3 用于聯合作用指數θ分析的藻響應溫差

θ分析用的聯合藥液的藻響應溫差：聯合藥液的藻響應通過三指標法，在9遍測溫結果中最大的藻響應溫差(△TABmax)用于θ分析。

游粱式抽油機具有結構簡單和可靠性高等優點,使其在采油設備中有廣泛的應用。抽油機都采用較大功率驅動電機來解決啟動問題,但正常運行時效率低下。抽油機的數量巨大,因而抽油機的節能降耗研究具有重要的意義[1]。為此進行了大量的探索,這些探索工作可以分成兩類,對抽油機機械結構的優化和對電機運行特性的改善。當抽油機上沖程時電機處于電動狀態;下沖程時,電機處于發電狀態會產生“泵升電壓”。這部分能量通常采用外接功率電阻,以能耗制動的方式將這部分能量消耗掉。雖然這種方案結構簡單,容易實現,但是功耗電阻的發熱有可能引發安全問題并縮短設備壽命,更重要的是造成了能量的浪費不利于油田的節能降耗。

θ分析用的單藥藥液的藻響應溫差：指標①中最大藻響應溫差(△TABmax)出現時刻(測溫遍數)的單藥的藻響應溫差(△TA、△TB)用于θ分析。單藥的藻響應溫差0時，以0計。當△TA=0、△TB=0同時出現時，重新測試藻溫。

1.5 聯合作用測試分析

步驟依次為參照濃度分析、聯合作用測試、聯合作用評價和重現性分析。

1.5.1 參照濃度的分析

參照濃度是指聯合作用測試時藥液濃度的配制標準。分析步驟依次為藻響應藥品的濃度梯度分析、敏感濃度分析和參照濃度分析。

(1)藻響應藥品濃度梯度的分析

圖1 倍半濃度梯度的測試杯布局Fig. 1 Arrangement of cups in test

藥液濃度梯度設計為N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32 (單位為g·L-1)，即倍半濃度梯度法。測試杯布局見圖1。

藻溫測試方法見1.2，藻溫現測現記。藻溫分析可用軟件分析，將測試的藻溫輸入AITAS 軟件，分析藻響應藥品濃度范圍。藻溫分析也可用人工分析，將測試的藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析藻響應藥品濃度范圍。如果沒有找到藻響應藥品濃度范圍，重新設計藥液濃度梯度再測試。

(2)藻響應藥品的敏感濃度分析

藻響應藥品的敏感濃度(簡稱敏感濃度)是指藥品濃度增減引起藻響應溫差增減的藥品濃度。首先進行同藥倍半關系濃度的初步分析。同藥倍半關系濃度是指引起藻響應溫差倍半變化的同一種藥的倍半濃度。因同藥一分為二測得的聯合作用為相加作用，用它來分析藥品的敏感濃度?？梢杂密浖治?，將測試的藻溫輸入AITHCAS，分析藥品的同藥倍半關系濃度。也可用人工分析，將測試的藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應溫差，再用1.4.3的方法，找出聯合藥液的最大藻響應溫差、單藥藥液的藻響應溫差，進行聯合作用指數θ計算(由于只有1個單藥的藻響應溫差，計算時單藥的藻響應溫差用乘以2來處理)，再根據聯合作用評價方法(1.4.2)分析同藥倍半關系濃度是否為相加作用。分析結果為相加作用，進行下一步分析。否則，重新測試。

接下來進行同藥倍半關系濃度的再現性分析。對初步分析的同藥倍半關系濃度再進行2次相同測試，如相加作用結果能夠再現，即通過再現性分析。這時同藥倍半關系濃度就是藻響應藥品的敏感濃度，可進行聯合作用測試時藥液配制的參照濃度分析。

圖2 二元聯合作用的測試杯布局Fig. 2 Arrangement of cups in binary combined effect test

測試杯布局見圖2，藻溫測試方法見1.2。相加作用分析可采用軟件分析，將測試藻溫輸入軟件AICEAS，分析相加作用。也可采用人工分析，將測試藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應溫差，再用1.4.3的方法，找出聯合藥液的最大藻響應溫差、單藥藥液的藻響應溫差，進行聯合作用指數θ計算，根據聯合作用評價方法(1.4.2)分析相加作用。如果分析結果為相加作用，即可進行參照濃度分析。

參照濃度確定的原則為在測試的2種藥品中，以毒性大的藥品的同藥倍半關系濃度的倍濃度、半濃度作為聯合藥液、單藥液配制的參照濃度。聯合藥液[A+B]=單藥液[A]+單藥液[B]，其中，單藥液[A]=單藥液[B]。參照濃度確定的方法為比較2種藥品的同藥倍半關系濃度，找出其濃度小藥品(即毒性大的藥品)，以其倍濃度、半濃度作為測試用的聯合藥液、單藥液配制的參照濃度。比如，測試同藥倍半關系濃度(g·L-1)時，A為4:2，B為2:1，B小于A，即B毒性大于A，根據參照濃度確定原則，以B的同藥倍半關系濃度作為測試藥液配制的參照濃度，聯合藥液濃度:單藥液的參照濃度為2:1。

1.5.2 聯合作用測試

(1) 藥液配制

按參照濃度確定的原則和方法配制測試藥液的濃度(1.5.1(1))。

(2) 藻溫測試

測試杯布局見圖2；藻溫測試方法見1.2。

(3) 藻溫分析

軟件分析：將測試藻溫輸入軟件AICEAS，進行聯合作用類型分析。

人工分析：將測試藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應溫差，再用1.4.3的方法，找出聯合藥液的最大藻響應溫差、單藥藥液的藻響應溫差，進行聯合作用指數θ計算。

1.5.3 聯合作用測試

根據聯合作用評價方法(1.4.2)分析聯合作用類型。

1.5.4 測試結果的重現性分析

首次聯合作用測試完成后，再進行2次相同測試，以有重現性的聯合作用類型作為最終測試結果。

2 結果(Results)

2.1 參照濃度分析結果

2.1.1 藻響應的重金屬濃度梯度

由表1可知，藻響應的重金屬濃度(g·L-1)梯度中Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)均為8、4、2、1、0.5、0.25；Fe(Ⅲ)為8、4、2、1；Al(Ⅲ)為8、1、0.5、0.25；Cr(Ⅲ)為8、4、2、0.25；Zn(Ⅱ)為8、4、2、0.5、0.25。

2.1.2 初步分析的同藥(重金屬)倍半關系濃度

由表2可知，初步分析的同藥倍半關系濃度(g·L-1)中，Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)為2:1，Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)為1:0.5，Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)為0.5:0.25。

2.1.3 同藥倍半關系濃度的驗證分析

由表3可知，同藥倍半關系濃度初步分析結果的再現性測試中，8種首測結果為相加作用的都具有再現性，首測結果相加作用的出現率為89%，表明首測結果的可信性高。1種首測結果為拮抗作用的沒有再現性，但最終結果為相加作用，且具有重現性。

表1 藻響應重金屬的測試結果Table 1 Test results of algae response to heavy metals

注：藻對藥液有響應用“+”表示，藻對藥液無響應用“-”表示。測試藻為滇池銅綠微囊藻，藻密度≥3.14×109個·L-1，環境溫度為17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： “+”, algae responds to liquid, “-”, algae didn’t respond to liquid; algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1；environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

表2 同藥倍半關系濃度初步分析結果Table 2 Preliminary analysis results of concentration relation for the same medicine

注：有相加作用為“+”，無相加作用為“-”。測試藻為滇池銅綠微囊藻；藻密度≥3.14×109個·L-1；環境溫度為17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： Additive effect is "+", no additive effect is "-"; algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

通過再現性分析的同藥倍半關系濃度(g·L-1)中，Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)均為2:1；Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)為1:0.5，Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)為0.5:0.25。根據敏感濃度定義，這些重金屬倍半關系濃度就是藻響應的敏感濃度。

2.1.4 藥液配制的參照濃度

由表4可知：①聯合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=0.5:0.25(g·L-1)的二元組合是：Cu2++Fe3+、Cu2++Mn2+、Cu2++Hg2+、Cu2++Cd2+、Cu2++Pb2+、Cu2++Zn2+、Fe3++Hg2+、Mn2++Hg2+、Al3++Hg2+、Cr3++Hg2+、Cu2++Al3+、Cu2++Cr3+、Hg2++Cd2+、Hg2++Pb2+、Hg2++Zn2+。②聯合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=2.0:1.0(g·L-1)的二元組合是： Cr3++Cd2+、Cd2++Zn2+、Pb2++Zn2+、Cr3++Pb2+、Fe3++Cd2+、Fe3++Cr3+、Fe3++Pb2+、Fe3++Zn2+、Cr3++Zn2+、Cd2++Pb2+。③聯合藥液參照濃度:單藥液參照濃度=1.0:0.5(g·L-1)的二元組合是：Fe3++Mn2+、Fe3++Al3+、Mn2++Cd2+、Al3++Cr3+、Al3++Cd2+、Al3++Pb2+、Al3++Zn2+、Mn2++Al3+、Mn2++Cr3+、Mn2++Pb2+、Mn2++Zn2+。

2.2 同藥倍半關系濃度的再現性和重現性

由表3可知，在9種重金屬的同藥倍半關系濃度分析中8種重金屬的首測結果為相加作用，其中6種首測結果的再現性為100%，另2種再現性為50%，全部首測結果再現性的出現率為89%；9種相加作用結果中，6種的重現性為100%，3種的重現性為67%；9種相加作用結果重現性的出現率為100%。分析表明，二元聯合作用藻紅外測試方法的測試效果較好。

表3 同藥倍半關系濃度的再現性分析結果Table 3 Reproducibility analysis results of concentration relation for the same medicine

注：測試藻為滇池銅綠微囊藻；藻密度≥3.14×109個·L-1；環境溫度為17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

表4 重金屬二元聯合作用藻紅外測試分析結果Table 4 Analysis results of binary combined effects of heavy metals in algae infrared test

續表聯合作用測試藥液Jointactiontestsolution第1次實驗Firstexperiment第2次實驗Secondexperiment第3次實驗Thirdexperiment二元組合Binarycombination參照濃度[兩藥]:[單藥]/(g·L-1)ReferenceconcentrationTwodrugs:Onedrug/(g·L-1)指數Index(θ)類型Type指數Index(θ)類型Type指數Index(θ)類型Type再現率Reappearancerate重現率Recurrencerate結果Result再現性的出現率Occurrencerateofreappearance重現性的出現率Occurrencerateofrecurrence總再現性出現率Totalrateofreappearance總重現性出現率TotalrateofrecurrenceCr3+,Pb2+2.0:1.00.51獨立Indepedent1.60協同Synergism1.90協同Synergism0%67%協同SynergismCu2+,Al3+0.5:0.251.09相加Additive0.34拮抗Antagonism0.09拮抗Antagonism0%67%拮抗AntagonismCu2+,Cr3+0.5:0.250.56拮抗Antagonism0.54拮抗Antagonism1.54協同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Cr3+2.0:1.00.09拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism1.67協同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Pb2+2.0:1.00.39拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism1.65協同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Zn2+2.0:1.00.08拮抗Antagonism0.43拮抗Antagonism0.15拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismMn2+,Al3+1.0:0.50.49拮抗Antagonism0.93相加Additive0.55拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Cr3+1.0:0.50.57拮抗Antagonism0.28拮抗Antagonism1.60協同Synergism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Pb2+1.0:0.50.35拮抗Antagonism1.06相加Additive0.36拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Zn2+1.0:0.50.50拮抗Antagonism1.42相加Additive0.37拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismCr3+,Zn2+2.0:1.00.42拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism0.35拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismHg2+,Cd2+0.5:0.250.40拮抗Antagonism0.25拮抗Antagonism1.43協同Synergism50%67%拮抗AntagonismHg2+,Pb2+0.5:0.250.27拮抗Antagonism0.50拮抗Antagonism0.66相加Additive50%67%拮抗AntagonismHg2+,Zn2+0.5:0.250.37拮抗Antagonism0.33拮抗Antagonism0.54拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismCd2+,Pb2+2.0:1.00.49拮抗Antagonism0.30拮抗Antagonism0.90相加Additive50%67%拮抗Antagonism0100%93%100%

注：測試藻為滇池銅綠微囊藻；藻密度≥3.14×109個·L-1；環境溫度為17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

2.3 測試結果的多樣性、再現性、重現性

由表5可知，在36組的聯合作用測試結果中，出現拮抗、相加、協同3種聯合作用類型，測試結果出現多樣性；14組拮抗作用中單組的再現性為50%～100%、多組的再現性的出現率為93%，單組的重現性為67%～100%、多組的重現性的出現率為100%，21組相加作用中單組的再現性為50%～100%、多組的再現性的出現率為86%，單組的重現性為67%～100%、多組的重現性的出現率為100%，1組協同作用的重現性為100%、重現性的出現率為100%；36組聯合作用測試結果的再現性為50%～100%、再現性的出現率為86%，重現性為67%～100%、重現性的出現率為100%。分析表明，二元聯合作用藻紅外測試方法的測試效果良好。

3 討論(Discussion)

3.1 測試結果的再現性與重現性

在同藥倍半關系濃度測試中(2.2)，相加作用結果的再現性、再現性的重現率和重現性、重現性的重現率都比較好。在聯合作用測試結果中出現的相加、拮抗、協同的聯合作用類型，每一種類型的再現性、再現性的重現率和重現性、重現性的重現率都比較好(2.3)。藻紅外測試技術有較好的測試效果，并細化了測試條件，改進了藻溫測試方法，提出了三指標評價法和參照濃度分析方法，修正了聯合作用偏差f值的結果。這樣，改進后的藻溫測試方法、三指標評價方法、重現性分析能夠保證藻響應溫差和藻響應藥品評價結果的質量，參照濃度分析方法、二元聯合作用評價方法、重現性分析能夠控制聯合作用分析結果的質量。

3.2 測試結果的多樣性

在聯合作用測試結果中出現了相加、拮抗、協同3種聯合作用類型，占4種聯合作用的75%，表現出一定的多樣性。當有多種聯合作用類型出現時，并且每一種類型具有較好的再現性、重現性，表明聯合作用評價法的f值=0.42是恰當的。當測試結果沒有多樣性時，表明f值過小或過大。

3.3 參照濃度及其分析方法的意義

聯合作用分析需要定量測出藥品參照濃度(敏感濃度)引起的藻響應溫差。因此，測試聯合作用最為關鍵的是藥液配制的標準，而參照濃度就是藥液配制的標準和依據，沒有參照濃度聯合作用測試便無可控性，也就沒有可信的測試結果，參照濃度在聯合作用測試中非常重要，因此它是聯合作用測試的關鍵技術。由于藻響應的有毒有害物都存在敏感濃度，那么，用參照濃度分析方法就可找出不同有毒有害物的參照濃度，因此藻紅外測試技術可用于測試重金屬、農藥、有機化學藥品、抗生素等的二元聯合作用。

3.4 軟件開發的必要性

在測試1組二元聯合作用時，配制藥液的參照濃度測試、聯合作用測試、重現性分析測試中，測試的藻溫數據巨大，而且不同數據需要專門分析，因此采用軟件處理即可提高分析速度又可避免人工分析易出現的差錯，因此數據處理軟件是二元聯合作用藻紅外測試技術的重要組成部分。

綜上分析，二元聯合作用測試結果具有較好的多樣性、再現性、重現性，這是由于測試條件、藻溫測試方法、藻響應溫差評價方法能夠保證藻響應溫差的質量，參照濃度分析方法、聯合作用評價方法、重現性分析等能夠控制聯合作用測試結果的質量。藻紅外技術測試重金屬二元聯合作用是可行的。參照濃度作為藥液配制的標準是可行的，在聯合作用分析中不可或缺。藻響應的有毒有害物都存在敏感濃度，用參照濃度分析方法可分析出藻響應有毒有害物的參照濃度，因此，藻紅外測試技術可用于測試重金屬、農藥、有機化學藥品、抗生素等的二元聯合作用。聯合作用藻紅外測試中，用AITAS軟件、AITHCAS軟件、AICEAS軟件將大大提高數據處理分析的效率。

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