肝脾舒對肝硬化大鼠腸屏障功能的保護作用

潘相學+祝峻峰+李勇

[摘要] 目的 探討肝脾舒對肝硬化大鼠腸黏膜屏障的保護作用。 方法 雄性SD大鼠36只，基于SAS proc plan 語句，按照體重從小到大的順序隨機分為4組，每組9只。空白組每日腹腔注射生理鹽水，模型組采用四氯化碳腹腔注射制備肝硬化模型，肝脾舒組和杜秘克組在模型組基礎上每日分別給予肝脾舒或杜秘克灌胃。取血漿檢測內毒素（ET）、二胺氧化酶（DAO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）水平，取肝組織和回腸組織行HE染色觀察病理變化。 結果 肝脾舒組血漿ET、DAO、TNF-α和IL-1β濃度明顯低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）；肝脾舒組血漿DAO、IL-1β濃度明顯低于杜秘克組，差異有統計學意義（P < 0.05）。肝脾舒組及杜秘克組的肝組織及回腸組織病理改變均優于模型組。 結論 肝脾舒對肝硬化大鼠腸黏膜屏障具有保護作用，可以截斷對腸黏膜屏障的損傷，進而影響肝硬化的發展過程。

[關鍵詞] 四氯化碳；腸黏膜；肝硬化；肝脾舒

[中圖分類號] R287 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0021-04

[Abstract] Objective To explore the protective effect of Gan Pi Shu on intestinal mucosal barrier in rats with liver cirrhosis. Methods A total of 36 male SD rats were divided randomly into 4 groups based on SAS proc plan sentence according to the order of weight to be large， with 9 rats in each group. The rats in the blank group were injected intraperitoneally with saline daily. The rats in the model group were injected intraperitoneally with carbon tetrachloride to establish the model of liver cirrhosis. The rates in the Gan Pi Shu group and the Duphalac group were given Gan Pi Shu and Duphalac respectively based on the model group. The plasma levels of endotoxin （ET）， diamine oxidase （DAO）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） were measured. The pathological changes of liver and ileum tissue were observed by HE staining. Results The plasma levels of ET， DAO， TNF-α and IL-1β in Gan Pi Shu group were lower than those of model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. DAO and IL-1β in Gan Pi Shu group were lower than those of Duphalac group， with statistically significant difference （P < 0.05）. The pathological changes of liver and ileum tissue in Gan Pi Shu and Duphalac group was better than that of model group. Conclusion Gan Pi Shu has the protective effect on the intestinal mucosal barrier in rats with liver cirrhosis， which can truncate the development process between intestinal mucosal barrier dysfunction and cirrhosis.

[Key words] Diamine oxidase； Intestinal mucosa； Cirrhosis； Gan Pi Shu

肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，晚期常出現上消化道出血、肝性腦病等全身各系統并發癥，病死率高。多項研究證實，腸屏障功能障礙與肝硬化并發癥密切相關，在其發生、發展中起到了樞紐的作用[1-3]。腸源性內毒素血癥（IETM）[4]是肝硬化患者常有的并發癥，在內毒素（ET）的作用下，腸道黏膜下固有層的肥大細胞被激活，通過活化脫顆粒釋放大量炎癥介質如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，通過一系列的生理、病理變化促進肝硬化的發展[5]，最終造成腸屏障功能損傷—內毒素血癥—肝損傷加重—多臟器衰竭的惡性循環[6-8]。因此，尋求有效的藥物，截斷肝硬化的發展，是當今醫學界面臨的重大課題。本研究應用中藥肝脾舒治療肝硬化獲得了良好的效果，進一步闡明了該藥的藥效機制。現報道如下：

1 對象與方法

1.1 實驗試劑

ET、TNF-α、二胺氧化酶（DAO）及IL-1β檢測試劑盒：南京建成科技有限公司；四氯化碳（CCl4）：成都科龍化工試劑廠（生產批號：150508）。endprint

1.2 實驗動物

SD大鼠36只，2個月大，平均體重（200±20） g，雄性，SPF級，由中國科學院實驗動物中心（合格證號：2013000649953）提供。實驗前于上海中醫藥大學附屬上海市中醫院實驗動物中心適應性飼養1周，飼養條件：符合晝夜光線變化要求的房間，恒溫（22～24℃）、恒濕（50%），所有大鼠均自由進水和進食。

1.3 動物造模

本研究應用CCl4的造模方法[9]，依據大鼠的體重分數，按0.3 mL/100 g的標準，每只大鼠給予40%CCl4溶液進行腹腔注射，首劑加倍（0.6 mL/100 g），隔日1次，持續注射90 d。

1.4 分組和處理

將大鼠按體重排序，基于SAS proc plan語句，36只大鼠被隨機分為4組，分別為空白組、模型組、肝脾舒組和杜秘克組（陽性對照組），每組各9只。各組在造模同時給藥，肝脾舒組給予肝脾舒20 mL/kg灌胃，藥物組成：虎杖（批號：13060064）、生白術（批號：1305068）、枳實（批號：1305024）、當歸（批號：1306015）、廣郁金（批號：1303042），所有藥物均為江陰天江藥業有限公司生產的顆粒劑，按照30 g ∶ 9 g ∶ 9 g ∶ 6 g ∶ 9 g比例混合，加水200 mL調成）。空白組、模型組用同等容量的生理鹽水灌胃。杜秘克組給予杜秘克（雅培生物科技公司，批號：253335），每日0.01 mg/kg灌胃。上述各實驗組均連續給藥90 d，各組大鼠均自由飲水，并應用普通飼料喂養。

1.5 檢測指標與方法

造模90 d，用烏拉坦（1.25 g/kg）行腹腔麻醉，然后抽取血液、剪取腸道及肝臟組織，檢測血漿ET、DAO、TNF-α和IL-1β，所有操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，應用723型分光光度計進行上述項目的檢測。取肝右葉及回腸部分組織，于l0%中性甲醛固定，經石蠟包埋、切片、脫蠟水化，常規HE染色后，應用普通光鏡觀察肝組織及回腸組織的病理變化。

1.6 統計學方法

所有數據均采用Origin 8.0統計軟件分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較，當方差齊性時，采用組間t檢驗，方差不齊時，采用t'校正檢驗進行統計分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時用SNK-q法，方差不齊時用Dunnett′s T3法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型評價

模型組與空白組血漿ET、DAO、TNF-α和IL-1β含量比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01），提示造模成功。見表1。

2.2 三組血漿ET、DAO、TNF-α和IL-1β含量比較

三組血漿ET比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。進一步兩兩比較，肝脾舒組ET水平低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）；與杜秘克組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。肝脾舒組DAO濃度低于模型組和杜秘克組，差異有統計學意義（P < 0.05）。肝脾舒組血漿TNF-α及IL-1β濃度均低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）；肝脾舒組TNF-α水平低于與杜秘克組，但差異無統計學意義（P > 0.05）；肝脾舒組IL-1β水平明顯低于杜秘克組，差異有統計學意義（P < 0.05）。杜秘克組TNF-α明顯低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 肝組織HE染色結果

空白組肝組織整體清晰、肝小葉分布正常，肝細胞排列規則，胞漿均勻，細胞核形態正常，肝血竇無異常改變。模型組大鼠的肝組織結構相對松散和更加紊亂，肝細胞存在大量的點狀及灶狀壞死，肝索模糊或消失，肝間質有大量的纖維組織增生，具有假小葉形成的特點。杜秘克組部分肝細胞發生氣泡樣變性，并有少量細胞發生了壞死，明顯存在肝小葉結構破壞，存在較多的纖維組織增生，但形成間隔較少。肝脾舒組盡管仍存在肝小葉結構受損的特點，但只有少量的纖維組織增生，并有少數肝細胞發生了氣泡樣變性，未見假小葉形成。

2.4 回腸HE染色結果

空白組大鼠的腸絨毛組織結構比較完整，排列整齊。模型組大鼠腸絨毛長短不一、結構比較紊亂，與空白組比較，大部分絨毛具有明顯縮短，部分出現斷裂、壞死及脫落，大腸肌層增厚。肝脾舒組和杜秘克組的HE染色相似，主要表現為腸絨毛排列基本整齊，結構基本完整，脫落、倒伏情況明顯好于模型組，只有部分絨毛存在局部變短的特點，肌層增厚。

3 討論

現代醫學認為，肝硬化的病因多為各種病毒侵襲人體（肝炎病毒屬中醫疫毒濕邪范疇），羈留體內，長期遷延不愈，或長期嗜酒酗酒，或長期恣食膏粱厚味等，導致肝臟代謝異常，形成肝硬化。因此，中醫學認為，濕熱邪毒是肝硬化的始動因素，并貫穿肝硬化的整個病機過程，而正氣虧損是肝硬化發展的內在原因，其盛衰的轉化是肝硬化轉歸的重要影響因素[10]。王靈臺[11]教授早年以清肝為則組方“清肝顆粒”進行各種肝病的治療，顯著改善了患者的肝功能，并對病毒復制產生了明顯的抑制作用。中醫五行學認為，肝屬木而脾屬土，肝病實則木克土，易乘脾犯胃，造成脾胃虛弱。所以中醫學有“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”的說法。“納呆、腹脹、便溏”是肝硬化患者的常見癥狀，也是中醫脾虛的典型癥狀，而事實上，這些癥狀與現代醫學腸道的功能密切相關，提示現代醫學的腸道、肝臟等臟腑共同囊括于了中醫學的肝脾理論中。在此基礎上，本研究以清肝實脾立法，組方肝脾舒，該方由虎杖、生白術、枳實、當歸和廣郁金五味基本藥物組成，臨床根據患者癥狀靈活化裁，用于病毒性、酒精性肝炎、肝硬化等各種類型肝病患者，療效滿意，明顯緩解患者臨床癥狀，有效防止并發癥的發生。此外，該方還具有顯著改善便秘患者腸道癥狀的作用[12]，起到了“四季脾旺不受邪”的臨床治療效果。endprint

肝脾舒方的君藥為虎杖，虎杖的主要有效成分為虎杖苷、白藜蘆醇以及大黃素等。研究認為，上述提取物有顯著的抗EI作用[13]；白藜蘆醇具有有效抑制TNF-α產生的藥理效果，同時，在重癥急性胰腺炎的發生中，該藥還具有抗氧化作用[14]。另有研究顯示[15-18]白藜蘆醇可通過增加活性氧含量，強化氧化應激，降低線粒體膜電位，在多發性骨髓瘤H929、人肺腺癌A549、彌漫大B淋巴瘤及卵巢癌SKOV-3細胞中啟動內源性凋亡途徑，誘導腫瘤細胞死亡。其主要成份大黃素抗菌抗病毒并促進腸道平滑肌蠕動的藥理效果目前已經被醫學界廣泛認可，能夠顯著發揮腸黏膜屏障的保護作用。另外，近年來的研究顯示，大黃素在抗肝纖維化方面也表現出了明顯的治療效果[19]。還有實驗表明[20]，大黃素尚可下調Wnt/β-catemin通路中的促血管生成因子表達從而抑制裸鼠結腸癌移植瘤的生長及微血管的形成。

本研究模型組肝組織HE染色的結果提示已經形成了肝硬化，另外，模型組血漿EI水平與空白組相比明顯升高，提示模型組已經形成了IETM。與模型組比較，而肝脾舒組與杜秘克組肝硬化病理變化的程度均有不同程度的減輕，血漿EI水平也顯著低于模型組。本研究結果顯示，模型組大鼠回腸HE染色提示其腸黏膜機械屏障受到較嚴重的損傷，而肝脾舒組回腸組織的HE染色較模型組有不同程度減輕。由于DAO主要存在于小腸黏膜絨毛上層細胞中，是該類胞質中具有高度活性的細胞內酶，因此，通過檢測血清中的DAO水平，能夠早期反映腸道的黏膜屏障功能。TNF-α、IL-1β為炎癥介質，其含量的增加顯示局部或全身炎性反應，本研究結果顯示，與空白組相比，模型組血清的ET、DAO、TNF-α、IL-1β水平明顯升高，提示模型組的腸黏膜上皮層受到一定程度的損傷，并存在EI血癥及全身炎性反應，肝脾舒組的血清DAO、ET、DAO、TNF-α、IL-1β水平較對照組低，提示中藥肝脾舒能夠減輕IETM，減輕炎性反應，對腸黏膜機械屏障、免疫屏障都具有一定的保護作用，這可能是肝脾舒減慢肝硬化進程的機制之一。

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（收稿日期：2017-09-18 本文編輯：王 娟）endprint