耳聾及耳聾高危人群中的GJB2基因熱點突變分析

姜志欣+林寧+石慧

[摘要] 目的 分析GJB2基因熱點突變在耳聾及耳聾高危人群中的突變譜和突變頻率。 方法 收集2014年11月～2017年3月江蘇地區耳聾患者59例及耳聾高危人群49例，應用熒光PCR法對其進行GJB2基因的4個熱點突變位點篩查，分析突變數據，通過直接測序法驗證其全部檢測結果。 結果 108例研究對象中，檢測出GJB2基因突變共84例，檢出率為77.78%。其中c.235del C、c.299-300delAT、c.176del16bp和c.512insAACG檢出率分別為62.96%（68/108）、17.59%（19/108）、13.89%（15/108）和0.93%（1/108）。耳聾患者中GJB2 c.235del C純合突變和GJB2雙等位基因突變發生率分別為30.51%（18/59）和28.81%（17/59），耳聾高危人群中未發現純合突變和雙等位基因突變。進一步采用直接測序法驗證全部檢測結果，其結果與熒光PCR法一致。 結論 在本研究中c.235del C是最常見的熱點突變，GJB2 c.235del C純合突變是最為常見的分子致病因素，其次是GJB2雙等位基因突變。

[關鍵詞] GJB2基因；熒光PCR；突變分析

[中圖分類號] R764.43 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0033-04

[Abstract] Objective To analyze the mutation frequency and spectrum of GJB2 gene hotspot mutations in the deafness patients and the high risk population. Methods There were 59 cases of deafness patients and 49 cases of high risk population in Jiangsu who were collected from November 2014 to March 2017. Four common mutations of GJB2 gene were detected by fluorescencence PCR technique. The mutation data were analyzed and summarized， and all results were further validated by Sanger sequencing. Results Allelic variants were observed in 84 of the 108 subjects with a positive rate of 77.78% （84/108）. The incidences of c.235del C， c.299-300delAT， c.176del16bp and c.512insAACG were 62.96% （68/108）， 17.59% （19/108）， 12.96% （14/108） and 0.93% （1/108） respectively. The carrying rates of homozygous genes in GJB2 c.235del C and biallelic mutations in GJB2 in the deafness patients were 30.51% （18/59） and 28.81% （17/59）. No homozygous genes and biallelic mutations were found in the high risk population. All results further validated by Sanger sequencing showed consistent with those by fluorescence PCR technique. Conclusion In this study， c.235delC mutation is the hotspot of GJB2 gene mutation. GJB2 c.235del C homozygous genes are the most common molecular risk factors followed by GJB2 biallelic mutations.

[Key words] GJB2 gene； Fluorescence PCR； Mutation analysis

先天性耳聾是人類最常見的出生缺陷之一，發病率為1‰～3‰。我國作為人口大國，聽力言語殘者多達2780萬，占殘疾人總數的33.58%，其中0～6歲聽障兒童達13.7萬，且每年新生聾兒2.3萬[1]。50%以上的先天性耳聾可能與遺傳因素相關[2]，已發現40多個與耳聾相關的基因，100多個基因位點[3]。其中縫隙連接蛋白beta2（gap junction protein beta2，GJB2）基因突變被認為是引起遺傳性耳聾的常見原因之一[4-7]。本研究應用熒光PCR法檢測江蘇部分地區耳聾及耳聾高危人群的GJB2基因，分析其突變譜和突變頻率，為耳聾及耳聾高危人群的遺傳咨詢和產前診斷提供理論基礎，探討采用熒光PCR法對耳聾高危人群檢測的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 對象

收集2014年11月～2017年3月來自于江蘇地區的研究對象108例，均為漢族，年齡1～49歲。其中耳聾患者59例，均為感音神經性耳聾，在醫生指導下填寫“耳聾基因篩查記錄冊”，獲取相關信息，包括一般情況、發病年齡、個人史及家族史；耳聾高危人群49例，為上述耳聾患者二代以內近親屬或配偶，聽力均正常。所有研究對象均簽署知情同意書，項目研究通過江蘇省計劃生育科學技術研究所倫理醫學委員會評審。endprint

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 TIANamp Blood DNA Kit（天根生物技術公司），GJB2基因檢測試劑盒（熒光PCR法）（濟南英盛生物技術有限公司），ABI 9700 PCR擴增儀。

1.2.2 基因提取 采集受檢者3～5 mL外周靜脈血（空腹），血液放入EDTA抗凝劑的真空采血管，統一編號。應用TIANamp Blood DNA Kit分離全基因組DNA，按試劑盒說明書操作，分光光度法檢測DNA濃度和純度，DNA濃度在1～300 ng/μL范圍內，純度（A260/A280）在1.7～1.9為合格。

1.2.3 基因檢測 采用GJB2基因檢測試劑盒探針特異性PCR技術，按照GJB2基因的4個常見突變位點（235delC、299-300delAT、176del16bp、512insAACG）的突變序列來設計高度特異的雙標記熒光TaqMan探針，通過在ABI 9700 PCR儀上進行PCR擴增，與模板DNA結合，收集熒光信號，累積曲線，實時讀取定性結果，判讀是否存在相關基因位點的突變。PCR反應條件見圖1。陰陽性質控擴增判讀見圖2、3，可依據此位點的陰陽性質控擴增圖判讀樣本該檢測位點的結果。全部結果進一步采用直接測序法進行驗證。

1.2.4 DNA測序 GJB2基因引物設計，PCR特異片段擴增體系、溫度、時間等條件的設置參照文獻[8]。PCR產物行2%瓊脂凝膠電泳，選取PCR擴增產物純化，在ABI3700自動測序儀上行直接測序（正反向測序），通過DNAstar軟件的SeqMan分析測序結果。

2 結果

2.1 GJB2基因突變情況

108例研究對象中，共檢測出GJB2基因突變84例，檢出率為77.78%。其中單等位基因突變67例、雙等位基因突變17例；純合突變20例、雜合突變64例；四個常見的位點c.235del C、c.299-300delAT、c.176del16bp和c.512insAACG突變檢出率分別為62.96%（68/108）、17.59%（19/108）、13.89%（15/108）和0.93%（1/108）。

2.2 不同研究對象中GJB2基因突變位點、突變方式及分布情況

耳聾患者中發現了20例GJB2純合突變和17例雙等位基因突變。其中c.235del C純合突變18例，c.299-300delAT純合突變1例，c.176del16bp純合突變1例。GJB2 c.235del C純合突變和GJB2雙等位基因突變發生率分別為30.51%（18/59）和28.81%（17/59）。耳聾高危人群中發現了36例GJB2突變基因攜帶者，攜帶率為72%（36/49），未發現純合突變和雙等位基因突變，見表1。采用直接測序法檢測全部研究對象的檢測樣本，結果與熒光PCR完全一致。

3 討論

在我國聽力殘疾是最常見的出生缺陷之一，是目前提高人口素質、改善生活質量所面臨的嚴峻公共衛生問題。隨著對耳聾分子病因學的研究，遺傳因素在耳聾的發病中得到越來越多的重視。遺傳性耳聾患者的60%～70%為非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing impairment，NSHI），又有80%的NSHI屬于常染色體隱性遺傳[9]。研究證實GJB2基因突變引起的NSHI耳聾較為常見[10-11]，GJB2基因編碼區為678 bp，主要由兩個外顯子組成，編碼區主要存在在外顯子2上[12]，其基因編碼產物為縫隙連接蛋白（Connexin-26，Cx-26），Cx-26分布于耳蝸的血管紋、基底細胞、螺旋緣凸、神經感覺上皮及耳蝸傳導纖維等處，參與細胞間信號介導和離子傳遞，突變的GJB2基因可能導致Cx-26異常，進而影響細胞間隙的連接功能，引起內耳鉀離子回收障礙而致耳聾[13-16]。

GJB2呈常染色體隱性遺傳，臨床相關癥狀為重度以上感音神經性耳聾，往往隔代遺傳，男女均可罹患，發現后可通過植入人工耳蝸干預，避免因聾致啞。在本研究人群中，c.235delC發生頻率最高，符合235delC為國內最常見的基因突變的結論[17-18]，GJB2 235delC純合突變是最為常見的分子致病因素，與以往研究結果[19-20]一致。另本研究非聾高危人群中共發現了36例GJB2突變基因攜帶者，攜帶率高達72%（36/49），明顯高于柳紅杰[18]、韓明昱[21]等的報道，分析其原因可能是目標人群不同，本研究目標人群主要來源于聾人及其直系親屬、配偶，柳紅杰[18]、韓明昱[21]等則為正常聽力孕婦。

聾啞人因自身情況特殊，在現實社會常以“聾-聾”婚配形式存在，聾人夫妻具有相同基因突變位點的概率大大增加，后代耳聾風險也相應增加。因此依據遺傳模式對聾人或突變基因攜帶者等高危人群進行檢出率較高的GJB2基因的突變檢測，進一步的進行相關婚育指導和后代遺傳性耳聾風險的評估很有必要。據此，廣泛開展耳聾基因篩查與耳聾產前診斷，實現遺傳性耳聾的二級預防，在婚檢或生育前進行耳聾基因篩查，可避免雙方均為同一耳聾突變基因攜帶者的夫婦生育聾兒。此外，通過孕期母親或新生兒的耳聾基因篩查，可及早地發現藥物性耳聾敏感個體、遲發性遺傳性耳聾個體，通過早期干預，可有效預防耳聾發生。

人類基因組的復雜性及耳聾基因的高度遺傳異質性加大了耳聾基因檢測的難度，給遺傳性耳聾的診斷及預防帶來了一定的困難。基因直接測序技術是目前應用最多的遺傳性耳聾檢測方法，也是迄今為止分子診斷學中基因突變檢測的金標準，其具有技術平臺標準化、結果直觀、準確性極高等優點，可以對任意基因進行全序列分析，但因其費時、費力且成本較高，這種方法尚不具備應用于大規模人群篩查的條件。耳聾高發致病基因及突變熱點存在種族和人群差異，國內開展的大規模耳聾分子流行病學研究表明，中國絕大部分遺傳性耳聾只與少數幾個基因有關，如GJB2、SLC26A4、12SrRNA及GJB3等[22-23]，為熱點基因篩查方法應用于大規模人群篩查提供了理論依據。本研究采用熒光PCR法檢測耳聾基因具有檢測基因位點選擇靈活、耗時短，高通量、低成本、操作簡便快捷、結果判讀簡單等優點，能夠滿足對中國人群耳聾基因熱點突變篩查的要求。endprint

[參考文獻]

[1] 第二次殘疾人抽樣調查辦公室.全國第二次殘疾人抽樣調查主要數據手冊[C].北京：華夏出版社，2007：2-38.

[2] Bitner-G1indzicz M. Hereditary deafness and phenotyping in humans [J]. Br Med Bull，2002，63（1）：73-94.

[3] Koy A，Freynhagen R，Mayatepek E，et al. Hereditary sensory and autonomic neuropathy with autonomic crises：A Turkish variant of familial dysautonomia [J]. J Child Neurol，2012，27（2）：191-196.

[4] Wei Q，Wang S，Yao J，et al. Genetic mutations of GJB2 and mitochondrial 12S rRNA in nonsyndromic hearing loss in Jiangsu province of China [J]. J Transl Med，2013，11（1）：163.

[5] Jiang H，Chen J，Shan XJ，et al. Prevalence and range of GJB2 and SLC26A4 mutations in patients with autosomal recessive nonsyndromic hearing loss [J]. Mol Med Report，2014，10（1）：379-386.

[6] Grillo AP，de Oliveira FM，de Carvalho GQ，et al. Single nucleotide polymorphisms of the GJB2 and GJB6 genes are associated with autosomal recessive nonsyndromic heating loss [J]. Biomed Res Int，2015，2015（7164）：318 727.

[7] 戴樸.遺傳性耳聾的預防和阻斷[J].中華醫學雜志，2007， 87（40）：2811-2813.

[8] 李建瑞，劉濤，嚴江偉，等.散發性耳聾GJB2基因突變分析[J].山東大學耳鼻喉眼學報，2011，25（6）：33-36.

[9] 盧彥平，程靜，韓冰，等.熒光定量PCR技術用于遺傳性耳聾基因檢測胎兒的21三體綜合征篩查的可行性[J].中華婦產科雜志，2011，46（6）：427-430.

[10] 王國建，張冠斌，袁永一，等.十五項遺傳性耳聾基因突變微陣列診斷芯片的臨床應用研究[J].中華耳科學雜志，2014，12（1）：6-10.

[11] 高雪，辛鳳，袁慧軍，等.遺傳性耳聾相關基因SLC26A4新突變致病性分析[J].中華耳科學雜志，2014，12（1）：26-29.

[12] Denoyelle F，Marlin S，Weil D，et al. Clinical features of the prevalent form of childhood deafness，DFNB 1，due to a connexin-26 gene defect：implications for genetic counseling [J]. Lancet，1999，353（9161）：1298-1303.

[13] Dai Z，Sun B，Huang S，et al. Correlation analysis of phenotype and genotype of GJB2 in patients with non-syndromic hearing loss in China [J]. Gene，2015，570（2）：272-276.

[14] Salman M，Bashir R，Imtiaz A，et al. Mutations of GJB2 encoding connexin 26 contribute to non-syndromic moderate and severe hearing loss in Pakistan [J]. Eur Arch Otorhinolaryngol，2015，272（81）：2071-2075.

[15] Tsukada K，Nishio S，Hattori M，et al. Ethnic-specific spectrum of GJB2 and SLC26A4 mutations their origin and a literature review [J]. Ann Otol Rhinol Laryngol，2015， 124（1）：61-76.

[16] Terrinoni A，Codispoti A，Serra V，et al. Connexin 26（GJB2） mutations as a cause of the KID syndrome with hearing loss [J]. Biochem Biophys Res Commun，2010， 395（1）：25-30.

[17] 鄭文波，羅建紅，酈云，等.中國人語前非綜合征性耳聾患者GJB2基因的突變分析[J].中華兒科雜志，2000，38（10）：610-613.

[18] 柳紅杰，劉日明，從江琳，等.育齡期夫婦非綜合征性耳聾基因突變位點檢測結果分析[J].中華生物醫學工程雜志，2016，22（3）：194-199.

[19] 陳紅勝，梅凌云，賀楚峰，等.湖南地區漢族非綜合征型耳聾相關基因檢測及熱點突變分析[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2013，19（6）：475-480.

[20] 劉亞蘭，汪俊程，鄧宇元，等.熒光PCR法在非綜合征型遺傳性耳聾基因診斷中的應用研究[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2016，22（5）：345-352.

[21] 韓明昱，楚嚴，盧彥平，等.孕期女性常見耳聾基因篩查與耳聾出生缺陷干預[J].中華耳科學雜志，2011，9（3）：289-295.

[22] 王國建，戴樸，韓東一，等.基因芯片技術在非綜合征性耳聾快速基因診斷中的應用研究[J].中華耳科學雜志，2008，6（1）：61-66.

[23] 石之驎，王沙燕，張阮章，等.非綜合征型感音神經性聾患兒GJB2基因突變分析[J].中國醫學創新，2016，13（21）：21-24.

（收稿日期：2017-10-23 本文編輯：任 念）endprint